摘要
研究背景: 银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性疾病，常发生在皮肤、指甲和关节等部位，全球患病率为2％至4％。银屑病的特征性皮损为银白色鳞屑性红色斑块，该病病程长、易复发、难治愈，严重影响患者的生活质量。目前认为银屑病是在一定的遗传背景下，受环境因素刺激，免疫细胞及其分泌的细胞因子与角质形成细胞相互作用，导致角质形成细胞过度增殖、异常分化和一系列炎症反应。这一病理过程中涉及各种免疫细胞、免疫分子、细胞因子、趋化因子、细胞内信号传导通路等多种因素，形成一个错综复杂的炎症调控网络，决定了银屑病发病和治疗的复杂性。然而目前银屑病的发病机制未完全明确，需要进一步研究。 表观遗传修饰是银屑病发病的重要机制之一。组蛋白甲基化水平的变化可能与银屑病的发生发展有关，组蛋白甲基化修饰可以对基因进行适当编程，调节银屑病相关分子的产生。赖氨酸甲基转移酶2C（KMT2C）赖氨酸甲基转移酶（KMT2A-D,F和G）家族的成员，通过结合增强子或启动子来调控基因转录。KMT2C参与细胞发育和衰老、DNA损伤反应、内分泌激素治疗敏感性等多种生物学功能的调控。有研究表明KMT2C与一些炎症性疾病，如类风湿性关节炎有关。在银屑病中，KMT2C的表达及生物学作用尚无研究，其调控机制也需深入探索。 磷酸肌醇-3-激酶调节亚基3（PIK3R3）编码P55PIK（也称为P55γ,PI3KP85调节亚基的一部分），对细胞增殖和下游炎症信号通路，特别是PI3K/AKT通路至关重要。既往有研究表明，PIK3R3可通过促进IL-6和IL-8的释放并激活AKT通路而加重银屑病。LncRNAs可以通过多种机制调控基因的表达。关于长链非编码RNA（lncRNAs）在银屑病中发挥作用的研究越来越多。 本研究分为三部分。 第一部分:KMT2C在银屑病中的表达和体外生物学作用 研究目的: （1）明确KMT2C在银屑病皮损组织和细胞疾病模型中的表达水平，研究KMT2C对角质形成细胞增殖及银屑病样炎症的影响。 （2）预测并验证KMT2C的下游靶基因及调控其表达的具体分子机制。 研究方法: （1）收集斑块状银屑病患者皮损和健康对照者正常皮肤组织,通过qRT-PCR和免疫组化验证银屑病皮损区KMT2C的表达。 （2）培养人正常角质形成细胞（NHEKs）、人永生化角质形成细胞（HaCaT和Ker-CT细胞株），给予M5刺激构建银屑病细胞模型后，采用qRT-PCR和westernblot实验检测KMT2C表达水平。 （3）转染KMT2C小干扰（siKMT2C）,分别采用CCK-8、EDU细胞增殖实验、流式细胞术细胞周期检测、westernblot实验和ELISA实验评估角质形成细胞增殖、周期和银屑病相关炎症因子表达水平。 （4）在M5刺激的细胞中敲低KMT2C,进行转录组基因测序并分析，通过qRT-PCR实验和westernblot实验验证靶基因PIK3R3的表达和相关信号通路的变化。 （5）利用CUT&TAG实验检测敲低KMT2C后PIK3R3的启动子和增强子上H3K4me3和H3K4me1的富集水平。 研究结果: （1）KMT2C在银屑病皮损中表达显著上调;银屑病角质形成细胞模型中,M5刺激后KMT2C的表达水平较对照组明显升高。 （2）敲低KMT2C导致角质形成细胞增殖减少，细胞周期停滞在G1期，细胞周期相关蛋白cyclinD1表达降低，M5诱导的细胞中IL-6、IL-8、CCL20和S100A9水平降低。 （3）敲低KMT2C可逆转M5处理角质形成细胞引起的PIK3R3水平升高和下游AKT/NF-κB通路激活。 （4）干扰KMT2C的表达可抑制M5诱导的PIK3R3启动子和增强子上H3K4me3和H3K4me1的大量富集。 结论: （1）KMT2C表达升高，促进角质形成细胞的增殖以及银屑病相关炎症反应。 （2）KMT2C可能通过PIK3R3启动子和增强子靶向调控PIK3R3,从而调节下游AKT/NF-κB通路。 第二部分FABP5P3/KMT2C/PIK3R3轴调节细胞增殖和炎症的机制研究 研究目的: （1）研究PIK3R3在KMT2C调控银屑病中的作用。 （2）检测FABP5P3在银屑病患者皮损组织和银屑病样细胞模型中的表达水平。 （3）验证FABP5P3是否靶向调控KMT2C及具体调控机制。 研究方法: （1）转染过表达PIK3R3质粒（oePIK3R3）、共转染siKMT2C与oePIK3R3后，分别通过CCK-8、细胞周期实验、westernblot实验和ELISA实验检测PIK3R3对角质形成细胞增殖、周期和银屑病样炎症反应的影响，通过westernblot实验检验AKT/NF-κB信号通路的改变。 （2）通过免疫荧光染色和qRT-PCR实验检测FABP5P3在银屑病皮损和银屑病样细胞模型中的表达水平。qRT-PCR和westernblot实验检测过表达和敲低FABP5P3后KMT2C的水平。 （3）利用生物信息学网站寻找同时与FABP5P3和KMT2C结合的RNA结合蛋白（RBP）,免疫荧光染色实验研究FABP5P3与RBP共定位情况，采用免疫共沉淀（RIP）实验验证RBP分别与FABP5P3和KMT2C的直接结合。 （4）敲低FABP5P3后，采用RIP实验验证其对RBP与KMT2C的结合的影响，采用放线菌DmRNA稳定性实验检测KMT2C的mRNA降解水平。 研究结果: （1）过表达PIK3R3可以逆转siKMT2C引起的角质形成细胞增殖减缓和IL-6、IL-8、CCL20、S100A9水平降低以及AKT/NF-κB信号通路的改变。 （2）FABP5P3在银屑病患者皮损区和银屑病样细胞模型中表达上调。 （3）RNA结合蛋白HuR可以与FABP5P3和KMT2C结合。敲低FABP5P3导致KMT2CmRNA水平降低、HuR与KMT2C的结合减少。缺乏FABP5P3或HuR显著加快了KMT2CmRNA的降解。 结论: （1）PIK3R3在KMT2C调控AKT/NF-κB信号通路、促进角质形成细胞增殖以及银屑病样炎症的过程中发挥重要作用。 （2）在银屑病中，上调的FABP5P3通过招募HuR增加KMT2CmRNA的稳定性。 第三部分KMT2C调控银屑病样小鼠表皮增生和皮肤炎症 研究目的: 明确KMT2C在体内是否参与调控银屑病表皮过度增生和皮肤炎症反应。 研究方法: （1）外用咪喹莫特（IMQ）诱导银屑病样小鼠模型，表皮内多点注射siKmt2c,采用改良PASI评分量表评估皮损严重程度;收集皮损组织，制作组织病理切片,HE染色观察表皮增生情况。 （2）实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、westernblot、组化染色技术检测KMT2C、PIK3R3和增殖、炎症相关蛋白的表达水平。 （3）采用组化染色技术分析KMT2C对Ki-67+细胞数目、对CD3+T细胞及CCR6+细胞趋化的影响。 研究结果: （1）外用IMQ成功诱导出银屑病样小鼠模型，敲低KMT2C可减轻银屑病样小鼠模型的表皮增生程度。 （2）抑制银屑病样小鼠的表皮中KMT2C的表达可以降低皮损中PIK3R3和炎症相关蛋白IL-6、IL-8、CCL20、S100A9水平。 （3）敲低KMT2C可减少IMQ诱导的银屑病小鼠的皮肤中的CD3+T细胞及CCR6+细胞的浸润。 结论: 下调KMT2C可以改善银屑病小鼠的疾病严重程度。
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