摘要
研究背景 多环芳烃(PAHs)化合物是一类广泛存在的环境污染物，其中一些化合物(如苯并[α]芘、苯并[a]蒽等)已被国际癌症研究机构(IARC)确定为致癌物。PAHs致癌机制与其暴露引起的机体免疫功能抑制有关，这与已经报道的肿瘤发生机制具有相同特征。因而再激活机体免疫功能以发挥抗肿瘤效应是癌症免疫治疗的重要策略。机体免疫活性细胞介导的先天和适应性免疫途径的激活是免疫疗法的基础,免疫活性细胞包括CD8+T细胞、CD4+T细胞和巨噬细胞等，免疫途径的激活受多种免疫机制调控，如环GMP-AMP合酶-干扰素刺激因子(cGAS-STING)介导的先天免疫途径,NF-κB炎症信号反应通路、趋化因子(CXCL9/10/11)-受体(CXCR3)信号介导的T细胞免疫反应等。因而，寻找能特异性激活抗肿瘤免疫反应机制的方法是该领域研究的热点问题。 组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(HDACi)是一种表观遗传调节剂，已被证明能通过重塑肿瘤免疫微环境发挥抗肿瘤作用。2-己基-4-戊炔酸(HPTA)是治疗癫痫药物丙戊酸(VPA)的衍生物，同属于HDAC抑制剂，并且其抑制HDAC活性的IC50(11-15μM)低于VPA(348-448μM)。本课题组前期研究发现，在PAHs所诱发的乳腺癌模型中，与VPA相比，HPTA在较低剂量下(细胞水平15μM,动物实验20mg/kg),可以发挥更高的抗肿瘤效力，具有促进肿瘤组织内M1型巨噬细胞浸润，促炎因子的释放以及增强CD8+T细胞效应功能等作用。潜在提示HPTA能通过调控炎症-免疫反应,激活免疫细胞功能发挥抗肿瘤作用。然而，HPTA如何调控炎症-免疫反应途径、cGAS-STING免疫通路，以及基于该通路对肿瘤治疗的临床意义等问题，目前未见报道。 综上，本课题提出如下科学假说:HPTA可能作为一种新型免疫激活剂，触发机体免疫应答机制实现抗肿瘤效应。基于本课题组建立的PAHs类致癌物7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)诱发的乳腺癌大鼠模型和细胞恶性转化模型，将开展以下研究:1.HPTA抗DMBA诱发的乳腺肿瘤作用;2.HPTA抗肿瘤的免疫调控机制:是否能通过增强CD4+/CD8+T细胞免疫效应发挥抗肿瘤作用，并探讨cGAS-STING通路、NF-κB炎症通路、趋化因子(CXCL9/10/11)-受体(CXCR3)通路在调控CD4+T细胞的招募和活化过程中的相互作用规律;3.评估cGAS-STING免疫通路的临床意义:探讨基于cGAS-STING通路相关基因(CSRGs)建立的预后生存模型，并评估其在预测乳腺癌患者预后价值和免疫治疗效果中的关键作用。 研究方法 1.HPTA抗DMBA诱发的乳腺肿瘤作用 研究模型建立:在动物水平上利用PAHs中一种强致癌剂DMBA建立了原发性乳腺癌大鼠模型;在细胞水平使用DMBA处理人正常乳腺上皮细胞(MCF10A)建立恶性转化的乳腺肿瘤细胞系(MCF10A-DMBA)模型。课题组前期已证明上述动物和细胞模型的可行性。 HPTA剂量选择:基于HPTA抑制HDAC活性的IC50范围为11-15μM,课题组前期确定15μM浓度的HPTA作用于肿瘤细胞研究;在动物模型中，课题组前期研究已证明VPA在相当于治疗临床癫痫病的治疗剂量200mg/kg的条件下，对大鼠具有抗肿瘤效果，并根据VPA和HPTA抑制HDAC活性IC50的作用，课题组前期研究确定了HPTA的使用剂量为20mg/kg,这与细胞实验中发挥抗肿瘤作用的有效剂量(15μM)接近。因此，本研究分别选用15μM和20mg/kg作为细胞和动物水平HPTA的使用剂量。 实验设计:DMBA诱导SD大鼠60天后，施加HPTA连续处理12天，处理后30天内，记录肿瘤体积动态变化，大鼠体重变化，肿瘤形态学变化。在处死大鼠前的24h,腹腔注射BrdU。HE染色检测肿瘤形态学变化;免疫组织化学(IHC)染色、TUNEL染色和免疫印迹技术(Westernblotting)检测肿瘤细胞增殖和凋亡标志物。 2.HPTA抗肿瘤的免疫调控机制 应用DMBA建立的研究模型，展开如下的实验设计: (1)HPTA对T细胞浸润和CXCR3+CD4+T细胞的影响:IHC检测HPTA对动物肿瘤组织中CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞浸润的影响;在乳腺肿瘤细胞上(MCF10A-DMBA和MCF7)施加HPTA处理,并收集条件培养基,与人外周血单个核细胞(PBMCs)共培养，流式分析CXCR3+CD4+T细胞群的变化，通过RT-qPCR和Westernblotting检测CD4+T细胞上CXCR3的mRNA和蛋白表达量。 (2)HPTA对趋化因子CXCL9/10/11的影响:在动物和细胞水平，检测HPTA处理后CXCL9、CXCL10和CXCL11的mRNA和蛋白表达变化;施加CXCL9/10中和抗体后，流式技术分析HPTA对CXCR3+CD4+T细胞的招募作用。 (3)HPTA对NF-κB通路的影响:Westernblotting检测HPTA处理后NF-κB通路的蛋白表达水平;使用NK-κB抑制剂JSH-23处理后，进一步检测HPTA对CXCL9/10表达的影响以及对CXCR3+CD4+T细胞的招募作用。 (4)HPTA对cGAS-STING通路的影响:HPTA处理后，分析cGAS-STING通路的变化;利用cGAS和STING质粒构建敲除的乳腺癌细胞系，并检测HPTA对cGAS-STING通路及Ⅰ型干扰素(IFN)信号的影响。 (5)HPTA对CD4+T细胞分化的影响:在大鼠肿瘤组织和体外共培养体系中,HPTA处理后，检测CD4+T细胞不同亚型(Th1、Th2、Th17和Tregs)的标志物变化，以及SOCS1/JAK/STAT通路的变化。另外，通过在体外建立CD4+/CD8+T细胞共培养体系,施加HPTA处理后分析CD8+T细胞功能标志物IFNγ和GranzymeB的变化。 3.评估cGAS-STING免疫通路的临床意义 (1)基于cGAS-STING通路建立乳腺癌患者预后风险评分模型和验证其预测的准确性:①建立乳腺癌患者预后模型:通过癌症基因图谱(TCGA)数据库获取了乳腺癌患者样本的综合信息(RNA-seq数据和临床资料)，通过基因型组织表达(GTEx)数据库获取正常乳腺组织样本的RNA-seq数据。根据每个样本基因的表达量进行差异基因(DEG)分析。基于基因信息数据库PathCards和免疫相关数据库ImmPort,筛选出免疫相关基因和CSRGs在乳腺肿瘤组织和正常乳腺组织中的DEGs。单因素Cox回归分析鉴定CSRGs中预后相关的DEGs;基于机器学习算法构建预后评估模型，在TCGA数据库和验证数据集中计算了每个模型生存相关的一致性指数(C-index),筛选出最佳的CSRGs预后评估模型，并计算TCGA数据库中每个样本的风险分数(riskscore)。②验证CSRGs模型预测乳腺癌患者生存的能力:通过基因表达综合(GEO)数据库收集GSE20685、GSE1456,GSE3494和GSE7390数据集作为验证集，使用Kaplan-Meier生存分析和ROC(Receiveroperatingcharacteristiccurve)分析验证CSRGs风险模型预测生存的准确性。③评估CSRGs风险评分模型与免疫治疗反应性的相关性:分别利用CIBERSORTx算法、TCGA数据库和GEO数据库获取乳腺癌患者样本的免疫细胞浸润水平、免疫检查点(ICP)表达水平和接受免疫治疗的乳腺癌队列的信息，以评估CSRGs模型对乳腺癌患者的免疫反应性的相关性。 (2)HPTA对CSRGs模型中预后基因表达水平的影响:应用DMBA-MCF10A细胞和DMBA诱导的大鼠乳腺肿瘤组织，检测HPTA处理后CSRGs模型中11个预后基因的mRNA表达水平。 研究结果 1.HPTA对肿瘤细胞的抑制作用 HPTA处理后显著减小肿瘤组织的体积，抑制肿瘤的生长。HE染色显示，相比于对照组，HPTA处理组肿瘤出现大量空泡状结构。HPTA可以抑制Ki-67和BrdU的表达。另外，HPTA增加TUNEL阳性凋亡细胞的数量，促进CleavedCasepase-3的表达和激活Bax/Bcl-2凋亡通路。 2.HPTA抗肿瘤的免疫调控机制 (1)HPTA通过趋化因子CXCL9/10招募CXCR3+CD4+T细胞:HPTA促进CD3+T、CD8+T和CD4+T细胞的浸润，并进一步发现HPTA上调CXCR3的表达，促进CXCR3+CD4+T细胞的招募。另外，HPTA促进肿瘤细胞中CXCL9和CXCL10的表达，使用CXCL9/10的中和抗体阻断其表达后，发现HPTA招募CXCR3+CD4+T细胞的能力被抑制。 (2)HPTA通过激活NF-κB通路促进趋化因子CXCL9/10的分泌:在动物和细胞水平发现，HPTA处理后NF-κB通路被激活。施加NF-κB抑制剂JSH23后发现，HPTA促进肿瘤细胞CXCL9/10的表达作用被抑制，CXCR3+CD4+T细胞的募集也相应的减少。 (3)HPTA通过激活cGAS-STING途径调控NF-κB通路:在大鼠肿瘤组织中，HPTA处理后cGAS-STING及其下游关键蛋白(TBK1、IRF3、NF-κB)的表达增加。在细胞水平，cGAS和STING敲除后逆转HPTA对该通路的激活作用，抑制TBK1、IRF3、NF-κB的表达。另外，HPTA促进Ⅰ型IFN(IFNα,IFNβ和ISG15)的表达，cGAS和STING敲除后显著抑制该作用。 (4)HPTA促进CD4+T细胞向Th1亚型分化:在动物和细胞水平发现，HPTA可以促进Th1亚群标志物表达，同时抑制Th2和Tregs亚群标志物的表达。并进一步发现HPTA促进Th1分化的机制与下调SOCS1水平和激活JAK/STAT信号通路有关。另外，细胞共培养结果显示HPTA激活的Th1型细胞在肿瘤微环境中促进CD8+T细胞的功能。 3.基于cGAS-STING通路建立的预后风险评分模型及临床意义 (1)建立乳腺癌患者预后风险评分模型并验证其预测的准确性:①基于CSRGs建立了预测乳腺癌患者生存的风险评分模型:通过单因素Cox回归筛选出11个与生存相关的CSRGs,包括POLR2K、PYCARD、HSPA8、NFKBIE、EIF2AK2、JUN、CCL5、IL18、PRKDC、IFNG、IL33。基于这11个预后基因，构建了8个机器学习算法在内的多种算法的复合模型，结果显示，随机生存森林模型(RSF)是最佳模型，该模型在TCGA数据库中C-index表型最高(0.894),在所有验证数据集中具有领先的平均C-index(0.70525)。因此，利用RSF模型计算TCGA数据库中1080例乳腺癌样本的风险评分，并获得中位风险评分(25.119)。根据中位数将患者分为高风险评分组(n=540)和低风险评分组(n=540),由此建立了乳腺癌患者预后风险评分模型。②CSRGs低风险组与良好预后有关:Kaplan-Meier生存分析结果显示低风险组患者的总生存期(OS)高于高风险组患者。同时在四个验证集中，同样的结果得到了验证。另外，ROC分析发现，验证集中3、5、7和10年生存的平均曲线下面积(AUC)平均值高于0.7。③CSRGs风险模型与患者免疫治疗反应性具有显著相关性:通过相关性分析，结果显示低风险组与更多浸润的免疫细胞具有正相关,9种代表性的ICPs在高低风险组中的表达均具有显著差异。通过分析乳腺癌症患者接受免疫治疗的反应，结果显示低风险组患者免疫治疗效果更好。 (2)HPTA对CSRGs风险模型中大多数预后基因的表达具有调节作用:在DMBA-MACF10A细胞中，HPTA可以上调大部分基因的表达，包括:CCL5、IFNG、JUN、NFKBIE、POLR2K、EIF2AK2、HSPA8和PYCARD,抑制IL33的表达，但JUN和IL18无显著性变化。在大鼠肿瘤组织中，HPTA可上调CCL5、IFNG、NFKBIE、POLR2K、EIF2AK2、HSPA8和PYCARD的表达水平，同时抑制IL33的表达;另外，JUN和IL18也无显著性变化。初步发现CSRGs风险模型中的大多数基因参与了HPTA介导的抗乳腺肿瘤作用。潜在提示本研究建立的CSRGs风险模型用于预测乳腺癌患者预后生存和免疫治疗效果的可行性。 研究结论 本研究发现:1.在DMBA诱导的原发性乳腺癌模型中，HPTA可以触发抗肿瘤效应;2.HPTA通过激活cGAS-STING通路和NF-κB通路，促进CXCL9/10-CXCR3轴招募CD4+T细胞，并通过激活JAK/STAT通路促进CD4+T细胞向Th1亚型分化，进而增强CD8+T细胞的效应功能，阐明了HPTA通过炎症通路-趋化因子-免疫细胞反应链发挥抗肿瘤作用的新机制;3.基于cGAS-STING通路筛选出11个乳腺癌预后相关基因，构建了预测乳腺癌患者预后和免疫治疗反应的风险评分模型。
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