摘要
肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumoniae)是一种条件性致病菌，会引起猪肺炎、乳腺炎、败血症等，尽管感染肺炎克雷伯菌的猪发病率和死亡率较高，但在猪中该菌引发的感染还未引起足够重视。随着各种抗菌药在畜牧业中的广泛使用，多重耐药(Multi-DrugResistance,MDR)菌株不断出现，菌株耐药性不断增强。同时动物及其肉样品可能是MDR菌株的储存库，而且MDR菌株可在人、动物和环境之间传播，给畜牧养殖业带来挑战。另外，电子零售商务的发展让很多农产品如猪肉更方便快捷地走向餐桌，但农产品食品的安全还未引起足够重视。本研究通过对养猪场、屠宰场和电商零售猪肉中的肺炎克雷伯菌进行流行病学调查及毒力和耐药特征分析，为开展猪源肺炎克雷伯菌的风险分析提供理论依据，为防控猪源MDR高毒力肺炎克雷伯菌的流行与传播提供思路。主要结果如下: (1)从采集到的452份样品中分离鉴定出59株肺炎克雷伯菌(13.05％),其中养猪场A肺炎克雷伯菌的分离率(51/148,34.46％)最高，大部分是从腹泻保育猪肛拭子中分离(19/51,37.25％)。屠宰场猪肉和电商零售猪肉中的肺炎克雷伯菌的分离率分别是7.69％(2/26)和6.82％(6/88)。 (2)采用MLST对59株肺炎克雷伯菌进行分型。结果发现有18种ST型，以ST37(n=13)、ST2802(n=9)、ST5003(n=8)和ST6(n=6)为优势ST型，ST6111为本研究中新发现的ST型。猪肛拭子和环境样品分离菌的ST型具有多样性，包括ST37和ST45,这些ST型的肺炎克雷伯菌在全球分布广泛并具有多种宿主，有跨地区和物种传播风险。 (3)采用PCR和qRT-PCR分别检测肺炎克雷伯菌20种毒力基因和4种铁摄取系统相关毒力基因的表达水平。结果发现有13种毒力基因被检出，iroE、entB、fimH、mrkD、uge、wabG和hlyA基因检出率高达100％。相比于健康猪，分离自腹泻保育猪的肺炎克雷伯菌与铁载体相关基因iutA、iucA、irp2和ybtS的检出率更高并且都上调表达，其中高毒力基因iutA最高倍数可达213倍。肺炎克雷伯菌在保育猪感染期间可能通过调控iutA、iucA、irp2和ybtS基因的表达发挥毒力作用。 (4)采用微量肉汤稀释法测定肺炎克雷伯菌对12种抗菌药的敏感性，并筛选产ESBLs的菌株;采用PCR和qRT-PCR分别检测肺炎克雷伯菌53种耐药基因和5种外排泵基因的表达水平。结果显示分离菌对美罗培南高度敏感，对其他11种抗菌药有不同程度耐药，有54.24％(32/59)的分离菌为MDR菌株。有88种耐药谱型，以多西环素和氯霉素耐药的菌株最多(44/59,74.58％)。值得关注的是，59株肺炎克雷伯菌中有3株产ESBLs的MDR菌株，分离菌对替加环素(TGC)的耐药率为25.42％(15/59)。PCR结果显示有20种耐药基因呈阳性，其中blasHV、oqxAB、tet(E)、tet(A)、aadA、floR、sul2和qnrS检出率均＞50％。qRT-PCR结果表明AcrAB-TolC通路基因acrA、acrB或tolC在大多数MICTGC=4μg/mL的菌株中表达量低，而在MICTGC=8μg/mL的菌株中过表达，最高表达量是敏感菌株的13.73倍。AcrAB-TolC外排泵通路acrA、acrB或tolC基因可能介导肺炎克雷伯中水平或高水平(MIC≥8μg/mL)TGC耐药。 (5)经第二代基因测序(Next-GenerationSequencing,NGS)技术对3株产ESBLs(MICTGC=4μg/mL)和1株MICTGC=8μg/mL的菌株测序发现4株肺炎克雷伯菌均携带多种毒力基因和耐药基因，毒力基因的种类以铁摄取和分泌系统为主。3株产ESBLs的肺炎克雷伯菌都携带β-内酰胺类耐药基因如blaSHV.1、blaCTX.M-3和blaTEM-1。测序注释结果序列与参考序列进行对比发现tet(A)基因存在双移码突变(S201A、F202S、V203F)和点突变以及oqxAB基因发生错义突变。肺炎克雷伯菌对TGC的耐药机制可能与tet(A)和oqxAB基因突变以及AcrAB-TolC外排泵的过表达有关。 总之，必须严格控制养猪场中抗菌药的使用以及环境、猪肉中肺炎克雷伯菌的污染。同时应加强监测猪源肺炎克雷伯菌ST6、ST37、ST45、ST2802、ST5003和ST6111,更加深入研究其致病性、耐药性和传播机制，以减少猪源MDR高毒力肺炎克雷伯菌的产生。
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