摘要
脱氧学腐镰刀烯醇(Deoxynivalenol,DON),俗称呕吐毒素，是由镰刀菌属产生的一种次级代谢产物，近年来在饲料及饲料原料中的检出率和污染率很高,严重危害动物健康养殖和人类食品安全。在畜禽中，猪对呕吐毒素异常敏感，且小肠是主要靶器官，DON污染可以引起肠道屏障受损、免疫系统紊乱，造成采食量下降，生长受阻。目前通过化学、物理和生物等方法可以对DON进行脱毒，但是这些方法会在一定程度影响饲料品质及营养成分的吸收。因此，亟需进一步阐明猪抵御DON诱导肠道损伤的调控机制，为今后通过分子设计的手段达到抗病育种提供思路，也为从本质上实现猪对DON的抵抗能力奠定基础。 组蛋白甲基化修饰属于表观遗传修饰的一种，其主要发生在组蛋白H3/H4的N末端尾巴上，组蛋白甲基化修饰可以调控基因的转录激活和转录抑制。MLL(MixedLineageLeukemia)家族是特异性针对组蛋白H3K4me3修饰的甲基化转移酶。MLL1可以调控白血病发生和基因表达，在细胞分化、细胞周期、胚胎发育、神经形成和端粒修饰等生物过程中发挥重要作用，但在DON的研究中关于MLL1和H3K4me3修饰鲜有报道。因此，本研究通过构建DON诱导猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)损伤模型，明确DON导致猪肠道细胞中MLL1的表达和H3K4me3修饰水平显著变化;此外，通过敲降MLL1进行转录组测序，利用流式细胞术、双荧光素酶报告、ChIP-qPCR等试验结合基因表达验证探究MLL1介导H3K4me3修饰水平调控DON诱导IPEC-J2细胞损伤的分子机制，试图从组蛋白甲基化修饰的角度探讨DON诱导猪肠道细胞损伤的调控作用。主要试验结果如下: 1.MLL1在DON诱导IPEC-J2细胞损伤机制中的功能研究 为探究MLL1在DON诱导IPEC-J2细胞损伤中的功能，我们测定间接免疫荧光、细胞凋亡、活性氧等指标，检测凋亡相关基因、抗氧化酶相关基因及细胞因子等基因的表达，发现DON处理IPEC-J2细胞后，细胞形态发生皱缩、拉丝，细胞骨架蛋白(α-tubulin)分布显著减少;细胞凋亡水平显著增加(p＜0.01);CASPASE3和BAK的mRNA表达水平升高(p＜0.01和p＜0.05),BCL-2表达水平显著下降（p＜0.01）;活性氧的水平显著上升(p＜0.01）,绿色荧光明显增多;SOD表达水平显著下降（p＜0.01）;IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α和NF-κB的表达显著上调（p＜0.01）。另外，在DON诱导细胞损伤中H3K4me3蛋白表达水平显著上升（p＜0.01）;其中MLL1表达差异极显著（p＜0.001）。敲降MLL1,发现干扰组在细胞分裂的S期比例极显著升高(p＜0.001），G2/M期比例显著降低（p＜0.05）;干扰组CDK2、CYCLINA2和P21表达显著高于对照组（p＜0.01）,CDK4的表达水平上升（p＜0.05）;干扰组细胞凋亡水平相较于对照组极显著增多（p＜0.001）;蛋白印迹检测Bax蛋白水平显著升高（p＜0.01）;cleaved-Caspase3蛋白水平显著增加(p＜0.01）;干扰组ROS荧光明显增多。由此表明，在DON诱导IPEC-J2细胞损伤中H3K4me3修饰水平和MLL1表达水平显著上调，敲降MLL1后细胞凋亡水平上升、细胞周期阻滞、氧化应激增强。 2.MLL1调控DON诱导猪小肠上皮细胞损伤的机制研究 为探究MLL1调控DON诱导IPEC-J2细胞损伤的分子机制，我们对MLL1干扰组和对照组的IPEC-J2细胞进行转录组测序分析。通过生物信息学分析，以|log2FoldChange|＞2和padj＜0.05为标准，发现差异基因中上调的有2591个，下调的有2760个;GO富集分析发现，生物过程部分主要富集到DNA复制和DNA代谢过程;细胞组分主要富集到细胞核和胞内细胞器;分子功能主要富集到RNA结合;KEGG富集分析发现，差异基因主要被富集到细胞周期、p53、细胞凋亡、TNF、DNA复制和细胞衰老等信号通路。挑选10个差异表达基因（TNFRSF1A、PCNA、HNMT等）进行qPCR验证，其表达趋势和测序结果一致。通过韦恩分析筛选出凋亡和TNF-α信号通路20个共同表达基因，查阅文献并利用qPCR检测基因表达，结果表明相较于对照组,MLL1敲降导致TNFRSF1A表达水平显著上调（p＜0.01）,因此确定TNFRSF1A作为MLL1调控DON诱导IPEC-J2细胞损伤的潜在靶基因。 3.TNFRSF1A在DON诱导的细胞损伤过程中的机制研究 为进一步明确MLL1介导TNFRSF1A对DON诱导IPEC-J2细胞损伤的调控作用，本试验利用在线软件预测出TNFRSF14基因有4个核心启动子区，设计截断型引物扩增不同目的片段序列连接到pGL3-basic线性载体，双荧光素酶报告试验验证基因核心启动子区位于上游391-441位点;另外，ChIP-qPCR结果表明在DON诱导IPEC-J2细胞损伤中TNFRSF1A基因启动子区H3K4me3富集增多。敲降TNFRSF1A后发现相较于对照组，干扰组细胞晚期凋亡水平和总凋亡水平显著减少(p＜0.01)。qPCR结果表明，干扰组IL-8表达水平下降(p＜0.05)、TNF-α的表达水平显著下调(p＜0.01)。以上结果表明，MLL1通过介导TNFRSF1A基因启动子区H3K4me3修饰水平进而调控DON诱导的猪肠道细胞损伤。 综上所述，本研究发现MLL1参与调控DON诱导IPEC-J2细胞损伤，结合转录组测序和试验验证进一步表明，MLL1通过介导TNFRSF1A基因启动子区的H3K4me3修饰水平调控DON诱导猪肠道细胞损伤。
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