1目的 炮制辅料原料黑豆的应用历史悠久,而辅料的质量不合格严重影响炮制饮片质量,甚至会降低饮片药效。目前,《中国药典》及各地炮制规范对黑豆活性成分含量和黑豆汁制备工艺参数未做明确规定,缺少质量评价方法,这将严重影响炮制后中药饮片质量。黑豆汁制首乌是临床常用的中药,具有“补肝肾、强筋骨”的作用。为了保证炮制饮片质量及饮片药效,本论文开展了黑豆质量评价优化、黑豆汁制备工艺参数具体化的相关研究,在此基础上,进行生、制首乌对骨关节炎的药效作用对比及炮制增效机制研究,为进一步拓展何首乌临床应用提供参考。 2方法 2.1黑豆质量评价优化 以《中国药典》2020年版为基础,收集15批来自不同产地的黑豆,按照《中国药典》标准进行性状鉴别、显微鉴别、检查(水分、灰分、浸出物)研究。然后运用考马斯亮蓝法测定黑豆水溶性蛋白含量。采用高效液相色谱法,建立指纹图谱,并以大豆苷、大豆苷元为对照品,对15批黑豆进行含量测定,建立黑豆质量标准草案。 2.2优选黑豆汁制备工艺研究 以《中国药典》2020年版为基础,采用正交设计法,选择加水量、煮制次数、煮制时间为考察因素,以总黄酮、浸出物、蛋白质含量为考察指标,对黑豆汁制备工艺进行优选。 2.3生、制首乌对骨关节炎的药效学研究 采用高效液相色谱测定生、制首乌主要活性成分含量差异,找出最主要成分和增量最大的成分。以SD大鼠为研究对象,分为7个组,每组6只,分别为正常组、碘乙酸钠模型组、双氯芬酸钠肠溶片混悬液组、何首乌低剂量组、何首乌高剂量组、制首乌低剂量组、制首乌高剂量组。连续治疗四周后取膝关节按并要求进行宏观拍照,最后结合膝关节病理切片进一步考察制首乌治疗骨关节炎的药效作用。 2.4制首乌增量主成分治疗骨关节炎的炮制增效机制研究 以SD大鼠原代软骨细胞为研究对象,采用CCK-8法检测软骨细胞活力;将软骨细胞分为四个组别,分别为正常组、TNF-α模型组、增量主成分组、地塞米松组,采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测相关mRNA和蛋白表达水平;采用气相质谱联用(GC-MS)技术进行非靶向代谢组学研究;采用分子对接方法对潜在靶点进行验证。 3结果 3.1黑豆质量评价优化 15批来自全国各地的黑豆分为青仁黑豆与黄仁黑豆两种,经鉴定均符合《中国药典》2020年版标准。在《中国药典》基础上拟新增黑豆水溶性蛋白质含量不得低于30%。并拟规定无论是青仁黑豆还是黄仁黑豆异黄酮大豆苷、大豆苷元含量总量不得低于0.01%。 3.2优选黑豆汁制备工艺研究 采用综合评分法结合正交实验优选制备工艺,考虑到实际生产能源消耗,优选黑豆汁的最佳制备工艺为8倍量水,每次煮制3h,共煮2次。 3.3生、制首乌对骨关节炎的药效学对比研究 根据生、制首乌特征图谱,以峰面积进行比较,大黄素为生、制首乌最主要的活性成分,且制首乌相对于何首乌大黄素增量最高。体内动物实验结果表明,与模型组相比,制首乌低、高剂量组关节软骨损伤较小,没有明显骨质增生出现。另外,HE与番红固绿染色结果显示制首乌低、高剂量组潮线完整,无骨质增生,可抑制软骨基质降解,促进软骨基质恢复。 3.4制首乌增量主成分治疗骨关节炎的炮制增效机制研究 通过对大黄素缓解骨关节炎作用机制研究发现,大黄素能够明显抑制炎症因子的表达,并改善Ⅱ型胶原(COL2A)及蛋白聚糖(ACAN)的表达。另外,非靶向代谢组结果显示,大黄素能够抑制软骨细胞总胆固醇、硬脂酸的异常表达;分子对接结果显示,APOE,ABCA1,LDLR,APOA1,SCARB1等可能是大黄素改善胆固醇代谢的重要潜在靶点。 4结论 本文在《中国药典》2020年版黑豆的质量标准的基础上,增加了黑豆水溶性蛋白、大豆苷及大豆苷元含量为质量检测指标,并规定水溶性蛋白质含量不得低于30%,大豆苷、大豆苷元含量总量不得低于0.01%,优化了黑豆的质量评价指标。同时优选了黑豆汁制备工艺为加8倍量水,每次煮制3h,共煮2次。最后通过非靶向代谢组学阐释了制首乌能够通过胆固醇代谢改善骨关节炎的炮制增效机制。本研究为何首乌治疗骨关节炎的临床应用提供了参考,为开发新的治疗药物或保健品提供了重要依据。