摘要
肠道上皮细胞间的紧密连接是肠道机械屏障的重要组成部分，其结构和功能的完整性对于维持肠道稳态平衡和预防肠道紊乱相关疾病具有重要意义。但是，紧密连接相关蛋白对外界刺激高度敏感，其中，高脂膳食是主要诱因之一。研究表明，高脂膳食激发肠道过度炎症反应是导致肠道紧密连接损伤的重要机制。因此，筛选具有抑制肠道过度炎症反应的天然活性成分对于干预肠道屏障功能紊乱相关疾病具有重要意义。我们前期研究发现生姜中的活性成分——6-姜烯酚具有很强的体外抗炎活性。在此基础上，本研究利用棕榈酸刺激人结肠癌上皮细胞Caco-2构建高脂膳食模式下的紧密连接蛋白损伤模型，通过分析6-姜烯酚处理后细胞完整性、通透性、紧密连接蛋白表达及定位、炎症因子及相关调控信号通路等指标，研究了6-姜烯酚对棕榈酸导致的人结肠上皮细胞损伤的保护作用;并结合生物信息学分析、细胞转染抑制实验等从microRNA调控角度探讨了6-姜烯酚保护作用的机制。 本文的主要研究内容及结果如下: (1)6-姜烯酚对Caco-2细胞的毒性效应及作用浓度筛选。Caco-2细胞培养21天后，通过测定细胞完整性指标TEER值和细胞通透性指标Papp值，表明单层细胞模型构建成功。不同浓度6-姜烯酚和棕榈酸处理后，采用MTT法分析细胞存活率。结果表明，当6-姜烯酚和棕榈酸浓度分别在0.625-2.5μM和100-400μM时，细胞存活率均在97％以上，与对照组无显著性差异，表明在该浓度范围内，6-姜烯酚和棕榈酸未对细胞产生毒性效应。因此，选择0.625、1.25、2.5μM浓度的6-姜烯酚和400μM的棕榈酸进行后续研究。 (2)6-姜烯酚保护Caco-2细胞抵御棕榈酸诱导的紧密连接损伤作用的研究。通过测定TEER和Papp值，发现400μM棕榈酸显著降低了Caco-2细胞单层完整性(TEER值降低48％),增加细胞旁路通透性(Papp值增加4.1倍)。与棕榈酸损伤组相比，6-姜烯酚处理显著恢复了细胞单层完整性，降低细胞单层通透性，并呈现剂量依赖效应。采用qRT-PCR和WB法检测6-姜烯酚对Caco-2细胞紧密连接mRNA和蛋白表达的影响。结果表明，与对照组相比，棕榈酸处理显著下调紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA与蛋白表达;6-姜烯酚处理显著恢复了它们的mRNA与蛋白表达量，其中2.5μM6-姜烯酚处理组效果最为显著。进一步通过细胞免疫荧光实验发现，棕榈酸处理组表现出较低的Claudin-1、Occludin和ZO-1表达水平，当加入2.5μM6-姜烯酚后，它们的表达量明显恢复。并且，6-姜烯酚处理显著抑制了棕榈酸导致的肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的激活。 （3）6-姜烯酚通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路缓解棕榈酸诱导的炎症反应。通过qRT-PCR和ELISA法检测了6-姜烯酚对主要促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响。与对照组相比，棕榈酸显著上调了上述炎症因子的含量，而6-姜烯酚显著降低了它们的水平。进一步采用qRT-PCR和WB实验分析了6-姜烯酚对TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响。结果表明，与对照组相比，棕榈酸处理组具有更高的TLR4和MyD88的表达量以及NF-κB的磷酸化水平;而6-姜烯酚处理显著抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活。 （4）靶向调控TLR4的miRNAs筛选及其功能分析。利用生物信息学预测工具筛选得到靶向调控TLR4的8个候选miRNAs,进一步通过PCR实验发现6-姜烯酚对miRNA-216a-5p的上调作用最为显著，且其表达量与预期结果一致。为深入分析miRNA-216a-5p在6-姜烯酚保护紧密连接中的作用，将miRNA-216a-5pinhibitor进行预转染细胞，发现抑制miRNA-216a-5p后，6-姜烯酚对肠道紧密连接的保护作用消失或显著下降，具体表现为:Caco-2细胞单层完整性降低，通透性增加，紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1的表达下降，TLR4/MyD88/NF-κB以及MLCK信号通路被激活，促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量上升。以上研究结果表明，6-姜烯酚对棕榈酸诱导的肠道紧密连接损伤的保护作用与其抑制细胞过度炎症反应有关，而且靶向调控TLR4的miRNA-216a-5p可能是6-姜烯酚作用的重要靶点。
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