摘要
酞酸酯，又称邻苯二甲酸酯(Phthalates,Phthalicacidesters,PAEs),是一种典型的增塑剂类化合物，能够增加塑料产品的稳定性，可塑性以及持久性等，同时具有良好的性价比和广泛的使用范围。由于PAEs并未聚合到塑料的基质中，而是以氢键或范德华力与之相连，这使得其很容易从塑料中逸散，进而对土壤生态环境产生一定的健康风险。目前，PAEs已成为全球第二大环境污染物，是中国农业土壤中最丰富的半挥发性有机污染物。因此，由其造成的污染问题和生态毒性效应愈加受到关注，并逐渐成为环境领域研究的热点。蚯蚓可以作为模式生物来评估目标污染物的土壤生态风险，但目前的研究主要集中于对PAEs毒性效应的描述，而关于其毒性作用机制尚不明确，尤其是分子水平的研究相对缺乏，亟待丰富。此外，目前开展的毒理学研究主要以OECD和ISO推荐的赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)和安德爱胜蚓(Eiseniaandrei)为模式生物，但作为表栖型(Epigeic)蚯蚓的代表，这两种标准蚯蚓并不能准确反映污染物对其他生态型蚯蚓的生态毒性效应，如内栖型(Anecic)的威廉环毛蚓(Metaphireguillelmi)等。因此，面对日益严峻的PAEs污染问题，全面揭示其毒性效应及相关毒性作用机制，探究不同蚯蚓对典型酞酸酯的敏感性，对于精准评估污染物的生态环境风险和保护土壤健康具有十分重要的意义。 基于以上问题，本研究选取使用量大、风险水平高的邻苯二甲酸二(2-乙基)己基酯(Di2-ethylhexylphthalate,DEHP)为目标污染物，以赤子爱胜蚓(E.foetida)和威廉环毛蚓(M.guillelmi)为典型的土壤模式生物，采用急性毒性和慢性毒性实验相结合的方法，联合酶学、分子生物学和组学等创新技术手段，分别从个体、组织、细胞、基因以及分子水平全面评估了DEHP对蚯蚓的毒性效应并揭示其毒性作用的分子机制，得出以下主要研究结果: (1)DEHP对两种蚯蚓在个体水平上的急性毒性相对较小，但污染物直接接触均能诱发蚯蚓不同程度的中毒症状。DEHP对M.guillelmi滤纸法和土壤法急性毒性实验的半数致死浓度(LC50)分别为3534.26μg/cm2和1221.15mg/kg,而对E.foetida的急性致死效应和体重的抑制影响明显小于M.guillelmi。此外，组织水平上，DEHP暴露能够导致两种蚯蚓表皮凹陷和脱落，中肠组织变薄等组织损伤。 (2)DEHP能够诱导两种蚯蚓氧化应激与DNA损伤。污染物暴露激活了蚯蚓体内ROS的含量，改变了关键抗氧化酶活性，并进一步诱导了蚯蚓细胞膜脂质过氧化损伤。在DNA损伤层面，DEHP暴露显著增加了细胞DNA氧化损伤和8-OHdG含量。此外，DEHP暴露还能改变蚯蚓线粒体呼吸通路上的ATP-6,NADH1和COX1/2等功能基因的相对表达，这对线粒体生物学功能的正常发挥和下游抗氧化功能酶的表达造成了潜在威胁。生态风险评估表明，DEHP对M.guillelmi表现出更强的毒性效应，而敏感生物标志物对DEHP污染物的生物学响应也取决于蚯蚓的种类和处理时间。 (3)DEHP可能通过改变蛋白质结构来影响关键酶活性。研究结果显示，DEHP污染物能够在分子水平上破坏SOD/CAT的蛋白质骨架结构，改变内源荧光微环境，进而影响蛋白质结构特性;分子对接模拟进一步验证了DEHP与两种关键抗氧化酶结合的可能性，并发现结合过程主要由氢键和疏水作用介导。 (4)DEHP暴露改变了两种蚯蚓肠道微生物群落结构，并影响肠道微生物稳态。DEHP暴露能够改变两种蚯蚓肠道微生物的群落多样性和稳定性，打破蚯蚓肠道微生物生态网络平衡。此外，研究还表明两种蚯蚓均能通过增加特定微生物丰度来加强对污染物的降解以应对环境压力，并做出适应性改变。 (5)转录组和代谢组研究进一步揭示了DEHP对蚯蚓毒性作用的分子机制。DEHP暴露后M.guillemi体内显著改变的DEG显著多于E.foetida,而这些显著改变的DEG主要参与了细胞和代谢过程以及膜成分的稳定性等生物学功能。此外，DEHP显著影响了E.foetida体内花生四烯酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及不饱和脂肪酸的生物合成3条代谢通路，而M.guillemi体内显著改变的代谢通路达到31条。这些结果表明DEHP对M.guillemi的毒性影响比E.foetida更强烈，前者筛选出更多的差异表达基因和更复杂代谢通路。 (6)M.guillelmi对DEHP的富集能力强于E.foetida。暴露阶段，两种蚯蚓土壤中DEHP的含量随着处理时间的增加而逐渐降低，并表现出一定的时间依赖性;恢复阶段,土壤中也发现了不同程度的DEHP残留，表明未降解的污染物可能通过蚯蚓粪便重新进入土壤。两种蚯蚓均能显著富集DEHP污染物，生物富集因子(BCFs)分别为1.48±1.27(M.guillelmi)和1.17±0.93(E.foetida),这表明M.guillelmi对DEHP污染物的富集能力大于E.foetida，其生物有效性也更强，说明DEHP对可能M.guillelmi表现出更强度毒性效应。 综上所述，本研究以两种不同生态型蚯蚓为土壤模式生物，从多水平、多层次、多角度全面评估了典型酞酸酯DEHP对蚯蚓的生态毒性效应，比较了不同蚯蚓对污染物的生物学响应，并筛选了多个敏感生物标志物。同时，采用分子对接模拟、微生物组学、转录组学和代谢组学等多种创新手段联合分析的方法，从蛋白分子结构、肠道微生物群落、差异基因表达以及代谢功能和代谢过程等全面揭示了DEHP对蚯蚓毒性作用的分子机制，相关研究结果将为准确评估酞酸酯生态风险和土壤环境健康提供重要依据。
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