摘要
陈皮是药食两用的中药材，黄酮类化合物是陈皮最重要的生物活性成分，可分为黄酮苷和多甲氧基黄酮。前期研究表明，未陈化的陈皮中黄酮苷的含量较高,而陈化后陈皮黄酮单糖苷及苷元含量较高，且陈皮陈化过程中药效物质的变化与微生物菌群关系密切。课题组前期从陈皮中筛选出8株具有转化作用的真菌，其中黑曲霉（AspergillusnigerCP-2）的转化作用尤为显著。因此本研究采用黑曲霉转化陈皮黄酮类化合物旨在探明陈皮陈化过程中黄酮类活性物质的变化规律及其形成机制，为陈皮的质量控制和标准化生产提供理论依据。本课题主要的研究内容及结果如下: （1）以未经陈化的陈皮黄酮提取物为研究对象，采用靶向代谢组学定性定量分析了A.nigerCP-2对陈皮黄酮提取物的代谢规律，从0h到24h,双糖苷类化合物的含量均显著降低，单糖苷类化合物的含量均显著上升。以芸香柚皮苷为特异性底物，建立稳定的转化体系:菌丝球数量30个，pH7.5,底物浓度1.5mmol/L,柚皮素产率为51.34％。明确A.nigerCP-2转化芸香柚皮苷的反应途径:芸香柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的作用下脱鼠李糖生成柚皮素-7-O-葡萄糖苷，柚皮素-7-O-葡萄糖苷在β-D-葡萄糖苷酶的作用下脱葡萄糖生成柚皮素。 （2）为了进一步探究黑曲霉转化陈皮黄酮的作用机制，首先对黑曲霉的全长基因组进行测序，结果显示:A.nigerCP-2组装后生物基因组一共获得13个contigs,组装的contigs的N50长度为424KB,组装的contigs的N90长度为200KB,基因组序列总长度为36.25MB,GC含量为48.37％。通过GO、KEGG、KOG数据库的比对发现在A.nigerCP-2的全部编码基因中有7个α-L-鼠李糖苷酶的相关基因，有32个β-D-葡萄糖苷酶的相关基因。 （3）在A.nigerCP-2转化芸香柚皮苷（Nur）的过程中，在不同的时间点其差异基因是不一样的。有6个α-L-鼠李糖苷酶、3个β-D-葡萄糖苷酶、3个水解酶的相关基因在转化8h和15h均显著高于0h,在空白对照组（葡萄糖Glu0h,Glu8h和Glu15h）均未检测到表达。三种酶的基因表达规律与黑曲霉转化芸香柚皮苷的柚皮素产率呈正相关。qRT-PCR验证结果表明2个α-L-鼠李糖苷酶的相关基因，4个β-D-葡萄糖苷酶的相关基因均在Nur8h组和Nur15h组的表达量均高于Glu0h组，与转录组学的结果相一致。 （4）对不同生长时期的茶枝柑皮的品质进行分析，发现从7月份到12月份，茶枝柑皮的总酚含量从0.33mgGAE/gDW下降至0.14mgGAE/gDW,4种黄酮类化合物含量均显著下降;DPPH自由基清除能力和ABTS+?的清除能力均显著下降，下降率分别为31.13％、49.27％。A.nigerCP-2接种茶枝柑皮(陈皮)，总酚含量、总黄酮含量以及抗氧化能力显著升高，发酵25d总酚含量、总黄酮含量以及抗氧化能力达到最高。芸香柚皮苷的含量显著下降，单糖苷和苷元类化合物显著升高。qRT-PCR验证表明，β-D-葡萄糖苷酶的相关基因(EVM0001196)在处理组中的表达量较高，而在对照组中的表达量较低。所有发酵陈皮样品均未检测出脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1。A.nigerCP-2发酵陈皮后，醛类、酯类、酚类、醇类等挥发性成分含量增加，烯烃类挥发性成分的含量下降。
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