摘要
罗非鱼(Oreochromismossambicus),又称非洲鲫鱼，是世界重要的养殖鱼类品种。我国罗非鱼养殖产量居全球第一，近年其加工业快速发展，但在加工过程中会产生大量的鱼皮、鱼骨等副产物。前人研究表明罗非鱼皮富含胶原蛋白和硫酸皮肤素(Dermatansulfate,DS),具有较高的开发价值。然而，常规的提取方法通常只提取其中的一种物质，没有充分利用原料，造成了原料的浪费。本研究以罗非鱼皮为原料，建立酶提酸促溶的方法同步制备硫酸皮肤素和胶原蛋白，并对提取的胶原蛋白、硫酸皮肤素进行理化性质分析，对硫酸皮肤素进一步分离鉴定并评价其抗炎活性，以期为同步开发罗非鱼皮硫酸皮肤素与胶原蛋白提供参考，为罗非鱼下脚料的高效利用提供的新途径。主要研究内容及结果如下: (1)罗非鱼皮硫酸皮肤素与胶原蛋白的同步制备工艺优化 以罗非鱼皮为原料，采用酶提酸促溶的方法对罗非鱼皮DS与胶原蛋白进行同步制备，经单因素和响应面优化，得到最佳工艺条件为:中性蛋白酶加酶量5930U/g,提取时间25.8h,提取温度28.5℃,料液比1∶40g/mL。该条件下罗非鱼皮DS得率可达(132.12±2.47)mg/100g(湿重计)，胶原蛋白提取率可达(53.14±0.34)％。 (2)罗非鱼皮胶原蛋白的理化性质分析 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外光谱扫描、红外光谱扫描、圆二色谱、热变性温度测定、扫描电镜、持水性测定、凝胶形成能力测定等对同步制备工艺制备的胶原蛋白进行理化性质分析，并对比不同方法提取的胶原蛋白基本凝胶特性差异。结果表明通过同步制备工艺制得的胶原蛋白(NSC)具有典型Ⅰ型胶原蛋白结构，三螺旋结构保留完整，并未因提取温度而发生变性;其热变性温度为35.8℃,与胃蛋白酶提取的胶原蛋白PSC(32.7℃)、热水提取的胶原蛋白HSC(22.4℃)相比，具有更高的热变性温度，热稳定性较好;扫描电镜结果显示，NSC的结构有一定改变，但仍保持了胶原蛋白的纤维状结构，HSC则因高温变性呈现薄片状结构。持水性测定结果显示，NSC在180min时仍能保持(86.08±1.15)％的水分;胶原蛋白凝胶化能力测定结果显示，NSC的凝胶化能力分别在pH为6.2及NaCl浓度为10mM时达到最大，且其凝胶化能力显著高于其他两种方法提取的胶原蛋白。 （3）罗非鱼皮硫酸皮肤素的分离纯化及结构分析 采用阴离子交换层析及乙醇分级沉淀进行分离纯化，并通过醋酸纤维素薄膜电泳、紫外光谱扫描、红外光谱扫描、高效凝胶色谱、高效液相色谱等对罗非鱼皮DS进行鉴定。结果表明:经阴离子交换层析分离纯化得到三个组分F1、F2、F3,得率分别为104.4、14.2和7.3mg/100g（湿重计）。对组分F1进行乙醇分级沉淀，得到的F1-2,经醋酸纤维素薄膜电泳初步鉴定为DS。理化性质分析显示F1-2的纯度由纯化前的87.86％提高到94.95％,蛋白含量降低至1％以下，氨基己糖含量、糖醛酸含量、硫酸基含量有不同程度的提高。F1-2的分子质量为33.56kDa。红外光谱扫描结果显示F1-2是一种含有乙酰氨基和硫酸基，构型为α型吡喃糖的糖胺聚糖。单糖组成分析结果显示，F1-2由葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡萄糖及半乳糖构成。 （4）罗非鱼皮硫酸皮肤素的抗炎活性评价 通过建立角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀模型，测定小鼠足肿胀度、血液指标、鼠肝脏SOD、MDA含量、足组织炎症介质（TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2）分泌量等来评价F1-2的抗炎活性。结果表明F1-2显著降低了小鼠足肿胀度，并降低了小鼠血液中白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞的数量，改善了足组织中炎症细胞的浸润现象，其中高剂量组效果明显;同时，F1-2通过提高小鼠肝脏SOD活力及减少MDA生成，减轻了角叉菜胶致炎引起的小鼠肝脏氧化应激，并呈现明显的量效关系。对小鼠足组织炎症介质水平的进一步分析表明，F1-2通过抑制炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的释放起到抗炎作用，且中、高剂量的F1-2对炎症介质的抑制作用明显。
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