摘要
木聚糖是自然界中一类重要的有机碳，分为三类:β-1,4-木聚糖、β-1,3-木聚糖和β-1,3/1,4-木聚糖。其中，β-1,3/1,4-木聚糖是海洋红藻特有的，广泛存在于海洋红藻细胞壁。木聚糖酶是木聚糖降解的关键酶。目前已知的木聚糖酶包括β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.1.8)和β-1,3-木聚糖酶(EC3.2.1.32),分别负责降解β-1,4-木聚糖和β-1,3-木聚糖。然而，能够特异性降解β-1,3/1,4-木聚糖的酶类，至今未见报道。从海洋细菌中挖掘β-1,3/1,4-木聚糖酶，对于揭示海洋中β-1,3/1,4-木聚糖的降解与再循环过程以及海洋红藻资源的开发利用都具有重要意义。课题组前期从一株海洋细菌中发现了一个潜在的β-1,3/1,4-木聚糖酶。本文中，通过系统发育分析以及酶的底物特异性和底物降解模式分析，表征了一类新型木聚糖酶:β-1,3/1,4-木聚糖酶，它们构成糖苷水解酶GH26家族中一个新的亚家族。进一步结合酶及酶-底物复合物的三维结构和突变验证，阐明了β-1,3/1,4-木聚糖酶的底物识别与催化机制。 (1)海洋细菌分泌的β-1,3/1,4-木聚糖酶的鉴定 Xyn26A是课题组前期发现的一个潜在的β-1,3/1,4-木聚糖酶。为了确认Xyn26A的进化地位，我们首先构建了Xyn26A及其同源蛋白与已知GH26家族代表序列的系统发育树，揭示出Xyn26A可能代表了GH26家族中一个新的β-1,3/1,4-木聚糖酶亚家族。随后，对其中的5个代表性蛋白序列(Xyn26A、AlXyn26A、CeXyn26A、PpXyn26A和CaXyn26A)进行异源表达和分离纯化。通过比较分析酶的底物特异性发现，这5个酶都只能降解β-1,3/1,4-木聚糖，不能降解β-1,3-木聚糖或β-1,4-木聚糖，这一底物特异性区别于已报道的β-1,3-木聚糖酶和β-1,4-木聚糖酶。最后，通过分析酶的底物降解模式，我们发现这些β-1,3/1,4-木聚糖酶特异性降解β-1,3/1,4-木聚糖中β-1,3-木糖苷键还原端的β-1,4-木糖苷键，揭示了β-1,3/1,4-木聚糖酶在糖链上特异性的作用位点。综上，我们发现并鉴定了一类新型木聚糖酶—β-1,3/1,4-木聚糖酶，它们构成GH26家族中一个新的亚家族。 (2)β-1,3/1,4-木聚糖酶A/Xyn26A的结构及其底物识别和催化机制 为了进一步揭示β-1,3/1,4-木聚糖酶底物特异性的结构基础，我们对5个β-1,3/1,4-木聚糖酶进行了蛋白结晶，得到了AlXyn26A的晶体结构。因此我们选取β-1,3/1,4-木聚糖酶AlXyn26A作为研究对象，研究其性质、结构及底物识别和催化机制。研究结果表明，AlXyn26A的最适酶活温度为40℃,最适酶活pH为7.0。AlXyn26A的整体结构为GH26家族典型的(β/α)8桶状结构。AlXyn26A与β-1,3-木聚糖酶Xyl4结构最为相似，但底物特异性不同。将二者进行比较分析发现，不同于Xyl4的开放式催化腔，AlXyn26A催化腔上方被两个柔性loop覆盖，形成一个具有狭窄出口的通道状催化腔。我们进一步解析了酶与混合键木三糖底物复合物E243A-X1,3X1,4X的结构，结合结构分析与突变验证，鉴定出AlXyn26A中负责结合和催化底物的关键氨基酸残基。AlXyn26A主要通过形成氢键和疏水相互作用与底物结合，分别以Glu147和Glu243作为催化酸/碱和亲核基团，通过保留机制进行催化。AlXyn26A催化腔上方的两个loop和通道出口都参与底物结合，因此，我们推测，β-1,3/1,4-木聚糖酶独特的通道状催化腔可能使得它们只能特异性结合和降解β-1,3/1,4-木聚糖。多序列比对和结构预测结果表明，β-1,3/1,4-木聚糖酶普遍具有通道状催化腔。等温滴定量热结果表明，AlXyn26A和Xyn26A都能高效结合X1,3X1,4X,无法有效结合β-1,3-木聚糖或β-1,4-木聚糖，进一步验证了上述推测。 本文鉴定了GH26家族一个新的β-1,3/1,4-木聚糖酶亚家族，揭示了这类新型木聚糖酶的底物特异性和底物降解模式，并阐明了它们的底物识别与催化机制，有助于揭示海洋中β-1,3/1,4-木聚糖的降解与再循环过程，为海洋红藻资源的开发奠定理论基础。
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