摘要
镉（Cadmium,Cd）是生态环境中一种常见的重金属污染物。近年来环保技术水平及环保标准的提高使急性镉中毒事件逐年减少，但生态环境中低水平镉污染对公共卫生安全的潜在危害日趋严重。前期研究已证实，高剂量镉通过干扰脂代谢平衡诱导代谢性疾病的发生，但环境污染水平的镉暴露是否影响脂代谢未见报道。肝脏是脂代谢的主要器官，高脂摄入的增加使脂肪肝发病率逐年上升。最新的流行病学调查显示环境污染物（如PM2.5）可加剧高脂诱导的脂肪肝病变，但环境剂量的镉暴露对高脂诱导脂肪肝的影响尚不明确。本文基于生态环境中镉污染水平及脂肪肝发病现状进行试验设计，先采用环境剂量的氯化镉对大鼠染毒4周，后进行6周高脂日粮饲喂，构建早期低镉暴露加剧脂肪肝损伤的体内模型;并结合体外试验，从线粒体稳态的角度探讨早期低镉暴露加重高脂诱导脂肪肝的分子机理。 1、早期低镉暴露对高脂诱导脂肪肝的影响 选取24只4周龄健康SD雄性大鼠（体重110～120g）,预饲1周后随机分为4组:对照（Cont）组，以基础日粮饲喂10周;高脂（HFD）组，以基础日粮饲喂4周，后以高脂日粮饲喂6周;低镉加高脂（Cd+HFD）组，以含2mgCd2+/kg日粮饲喂4周，后以高脂日粮饲喂6周;镉（Cd）组，以含2mgCd2+/kg日粮饲喂4周，后以基础日粮饲喂6周。试验结束，采集血清和肝脏进行各项生物学指标检测。结果表明，与Cont组相比，Cd组大鼠肝脏未见明显的病理性损伤，肝TG和TC水平、血清中肝损伤标志酶（AST、ALT）活性及血脂水平均无显著差异;HFD组大鼠肝细胞表现严重的脂肪变性，但未见明显的炎症细胞浸润，肝TG和TC水平、血清中肝损伤标志酶活性显著上升，血脂代谢异常，表明饲喂6周高脂日粮诱导大鼠脂肪性肝损伤。与HFD组相比,Cd+HFD组大鼠肝细胞脂肪变性程度加重并伴有炎性细胞浸润，且NAFLD病理学评分显著升高;Cd+HFD组肝脏及血清中脂代谢的相关指标与HFD组相应值存在显著差异。上述结果表明，早期低镉暴露显著增强高脂诱导的肝脏脂肪变性程度，促进非酒精性脂肪肝发展为非酒精性脂肪性肝炎，提示环境剂量的镉暴露是脂肪肝病程发展的重要风险因子。 2、早期低镉暴露加重高脂诱导的肝细胞线粒体功能障碍 大鼠肝细胞系暴露于2.5μMCd4h和/或200μM棕榈酸(PA)24h,建立早期低镉加重高脂诱导脂肪肝的体外模型。通过体内模型结合体外模型，从线粒体功能的角度深入研究了早期低镉暴露加重高脂诱导脂肪肝的机制。结果如下:大鼠肝组织转录组学结果显示，HFD组和Cd+HFD组共鉴定出236个上调和473个下调的差异表达基因，KEGG通路分析显示差异表达基因主要富集于线粒体功能相关的通路。透射电镜观察体外培养细胞线粒体超微结构的结果显示，与Cont组相比，Cd、PA和Cd+PA组线粒体形态异常，且Cd+PA组线粒体损伤程度高于PA组，主要表现为线粒体嵴减少或消失及线粒体外膜破裂。对比体内外模型中各组ATP含量发现，Cd、HFD和Cd+HFD组的ATP水平均显著低于Cont组，且Cd+HFD组的ATP水平显著低于HFD组，表明Cd与高脂处理导致肝细胞线粒体功能障碍。体外研究发现，Cd、PA和Cd+PA组的肝细胞线粒体功能显著低于Cont组，且Cd+PA组的肝细胞线粒体功能显著低于PA组，表现为线粒体膜电位降低，线粒体动力学稳态失衡及线粒体ROS(mtROS)水平的升高。以上结果表明，肝细胞线粒体功能障碍在早期低镉暴露加重高脂诱导脂肪肝发病过程中发挥关键作用。 3.低镉暴露通过干扰TFEB转录活性抑制线粒体自噬以加重高脂诱导的脂肪肝 线粒体自噬是细胞清除受损线粒体的重要机制。本研究通过对体外模型进行目标质粒转染及相关药物干预，采用蛋白免疫印迹法、免疫荧光-激光共聚焦技术、染色质免疫沉淀实验等技术明确线粒体自噬是否参与早期低镉加重高脂诱导的线粒体功能障碍。结果如下:与PA组相比，Cd+PA组显著降低线粒体LC3-Ⅱ(mito-LC3Ⅱ)蛋白水平及自噬标志蛋白LC3和线粒体膜蛋白Tom20的共定位，显著增强线粒体标志分子COXⅣ和HSP60的蛋白水平，表明Cd+PA组进一步抑制了线粒体自噬。为明确参与线粒体自噬的受体，本研究检测了Parkin、BNIP3和FUNDC1的蛋白水平。对比各组线粒体自噬受体蛋白水平，发现早期低Cd暴露仅抑制高脂降低的线粒体自噬受体FUNDC1的蛋白水平。进一步通过目标质粒转染调控FUNDC1蛋白水平，发现过表达FUNDC1可改善Cd+PA诱导的线粒体自噬失调、线粒体功能受损及肝细胞脂肪变性，表明FUNDC1介导的线粒体自噬参与了Cd+PA诱导的肝细胞脂肪变性。针对FUNDC1启动子区域设计引物，通过筛选并结合ChIP试验检测调控FUNDC1的转录因子。结果发现转录因子EB(TFEB)通过结合FUNDC1的启动子调控FUNDC1的转录，进而影响FUNDC1介导的线粒体自噬。此外，调控TFEB的表达可改善Cd+PA诱导的线粒体功能障碍及肝细胞脂肪变性，但敲低FUNDC可显著抑制TFEB对肝细胞脂肪变性的缓解作用，表明TFEB通过调控FUNDC1介导的线粒体自噬发挥对早期低镉加重高脂诱导脂肪肝的保护作用。以上结果表明，早期低镉通过干扰TFEB转录活性抑制FUNDC1介导的线粒体自噬以加重高脂诱导的脂肪肝。 4.早期低镉通过靶向SIRT1/TFEB通路加重高脂抑制的线粒体自噬 TFEB在调节线粒体自噬中发挥重要作用，但TFEB调控线粒体自噬在早期低镉加重高脂诱导脂肪肝中的机制尚不清楚。因此，本研究结合体内外模型系统探讨了TFEB参与早期低镉加重高脂诱导脂肪肝发展的可能机制。结果如下:RNA-seq测序筛选差异基因的结果显示，Cd+HFD组蛋白去乙酰化酶SIRT1水平显著低于HFD组，且验证结果与测序结果一致。PPI网络发现SIRT1可激活转录因子TFEB,进一步结合目标质粒转染及激活剂调控SIRT1蛋白水平，发现SIRT1可调控TFEB的入核及其核内乙酰化修饰，影响TFEB的转录活性。此外，过表达SIRT1显著改善Cd+PA诱导的线粒体自噬失调、线粒体功能受损及肝细胞脂肪变性，但敲低TFEB可显著抑制SIRT1对肝细胞脂肪变性的缓解作用。同时，本研究也证实了SIRT1可调控Cd+PA所抑制FUNDC1介导的线粒体自噬，且该过程严格依赖于TFEB,明确了SIRT1-TFEB-FUNDC1通路在早期低镉加重高脂诱导脂肪肝中的作用。最后，鉴于线粒体在脂肪肝发病中的重要作用，本研究进一步证实了Cd+PA抑制的SIRT1-TFEB-FUNDC1通路通过产生过量mtROS加重脂肪肝的发展。以上研究结果表明，早期低镉抑制的SIRT1通过靶向调控TFEB,阻滞FUNDC1介导的线粒体自噬，导致胞内mtROS大量累积而加重高脂诱导的脂肪肝。 综上所述，本研究得出如下结论:早期低镉暴露加重高脂诱导的脂肪肝，且线粒体功能障碍在此过程中发挥重要作用;早期低镉暴露通过干扰TFEB转录活性抑制FUNDC1介导的线粒体自噬以加重高脂诱导的脂肪肝;早期低镉暴露通过靶向SIRT1/TFEB通路加重高脂抑制的线粒体自噬，诱导mtROS过度积累，加重脂肪肝的发展。本文丰富和补充了环境污染物作为重要的风险因子加重高脂诱导脂肪肝发展的新认知，为从线粒体保护角度防治早期低镉加重高脂诱导脂肪肝提供了重要理论依据。
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