摘要
葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea(Moug.)Ces.&DeNot.)引起的苹果轮纹病(Appleringrot),在世界各苹果产区均有发生，主要为害苹果果实及枝干、造成果实腐烂，严重威胁苹果生产。类病毒(viroid)是一类仅由250-430个核苷酸(nts)构成的单链环状RNA分子，能够系统侵染高等植物，并可引起作物发病，但未见其在自然条件下侵染真菌的报道。本研究从表现弱毒特性的B.dothideaXA-3菌株中检测到一类小的核酸分子，可能为类病毒或类病毒类似生物因子，并对该小核酸分子的分子特性、生物学特性及其与寄主弱毒特性之间的相关性进行了研究。主要研究结果如下: 本文通过垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳、随机克隆、RT-PCR扩增、序列比对以及酶消化验证(DNaseⅠ、S1核酸酶、RNaseⅢ、RNaseR),从XA-3菌株中鉴定了一组大小为157、221、374、396、429和450nt的环状RNA分子，命名为BdcRNA1(450nt)、BdcRNA2.1-2.3(374nt、396nt、429nt)和BdcRNA3.1-3.2(157nt、221nt)。将BdcRNAs与B.dothidea基因组比对，显示无同源性;与NCBI数据库登录序列进行比对，也没有检测到具有相似性的序列，表明BdcRNAs可能为B.dothidea中尚未报道的外源核酸分子。比较发现BdcRNAs核苷酸序列间相似性较低，相互之间相似性为25.6％-32.5％,在BdcRNAs核苷酸序列中存在一个大小为30nt的保守区域。对BdcRNAs的二级结构进行预测，结果显示均呈现出多分枝状的构象。 体外转录合成BdcRNAs二聚体RNA,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，显示BdcRNA2.1二聚体RNA被剪切为941、823、547、429、394和118nt6种不同大小的片段，BdcRNA1和BdcRNA3核酸条带无变化，说明BdcRNA1和BdcRNA3无核酶活性，而BdcRNA2具有核酶活性。通过回收BdcRNA2最小剪切片段进行末端克隆，显示核酶自剪切点位于第66-67位碱基A66G67之间。与已报道的类病毒锤头酶和其他核酶相比，BdcRNA2.1核酶序列没有相关保守结构和保守基序，显示与报道的核酶不同，可能为一种新型核酶。 为了分析BdcRNAs在寄主中的亚细胞分布，对XA-3及对照菌株原生质体进行荧光原位杂交。结果显示，BdcRNAs两条极性链均主要集中在真菌的细胞核内，表明它们在细胞核内复制。为了进一步明确其复制方式，采用RNaseR消化结合Northernblotting的方式，对XA-3中BdcRNAs的核酸链极性及其环状和多聚体的累积状况进行分析，推测BdcRNAs主要通过对称滚环复制的模式在B.dothidea中复制。其中，BdcRNA2复制过程中可能通过自身基因组核酶对复制中间体进行剪切，BdcRNA1、BdcRNA3则可能需要借助真菌细胞内的酶完成复制中间体的剪切。综上所述，推测BdcRNAs在真菌寄主细胞核内以对称滚环复制的模式进行复制。 鉴于与真菌病毒BotryosphaeriadothideaRNAvirus1（BdRV1）共侵染寄主菌株,为明确BdcRNAs不依赖BdRV1独立复制，从XA3总RNA中回收BdcRNAs核酸转染对照菌株MAO-2原生质体，获得4株阳性转化子。Northernblotting分析继代培养6代阳性转化子内BdcRNAs累积情况，结果显示BdcRNAs含量和核酸条带类型与亲本菌株XA-3相似，表明通过转染进入细胞的BdcRNAs在不携带BdRV1的菌株中也可以进行复制。综上所述，BdcRNAs能够独立侵染寄主，不是BdRV1的卫星RNA。 通过转染BdcRNAs二聚体RNA至MAO-2原生质体内，获得了BdcRNA2转化子（T32-x）及BdcRNA3转化子（T14-x）。将转化子接种到含KCl、NaCl、SDS、CaCl2、H2O2、Glucose及Sorbitol的PDA平板上，结果显示，BdcRNA3转化子与MAO-2相比，在含NaCl的培养基上表现出更强的抗胁迫能力;BdcRNA2转化子与MAO-2相比，对高盐胁迫、氧化还原胁迫、Ca2+胁迫、高浓度单糖及单糖衍生物胁迫表现得更为敏感。此外BdcRNA2转化子接种于梨果实及枝条上，形成的病斑显著小于MAO-2,表明BdcRNA2可能影响了真菌的致病力。为初步探究BdcRNAs对寄主的影响，将转化子T32和T14进行转录组测序。测序结果显示，BdcRNA3转化子T14共有差异表达基因2579个，主要富集到次生代谢产物的合成、糖酵解、RNA转运、抗生素生物合成、内质网蛋白质加工等通路;BdcRNA2转化子T32共有差异表达基因1735个，主要富集到核糖体生物合成、RNA降解通路，淀粉及蔗糖代谢、果糖及甘露糖代谢等代谢通路上，推测BdcRNA2可能影响了真菌抗逆性及致病力。 本研究在国际上首次报道了能够自然侵染真菌的外源环状RNA,并提供了外源环状RNA在真菌内的亚细胞定位、复制、分布和移动的证据。BdcRNAs代表一类新的基因组成上处于生命边缘的非细胞生物，具有基因调控功能，是一类新的表观信息调控携带因子。该研究为深入认识环状RNA的起源、进化及采用环状RNA开展作物真菌病害的生物防治打开了一扇新的窗口。
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