摘要
研究背景: 子痫前期(preeclampsia,PE)是指妊娠20周以后出现的一种妊娠期特有的综合征,通常以高血压和蛋白尿为首发表现，严重者可伴发有多脏器功能受损、胎盘早剥甚至胎死宫内等，是孕产妇及围产儿发病率和死亡率升高的主要原因之一。因缺乏有效的治愈手段，为防止出现严重母儿并发症，很多时候需要提前终止妊娠，造成极度的早产甚至流产。因此，对PE发病机制进行深入的研究，寻求有效的治疗手段，是目前亟待解决的问题。 PE的发病机制是复杂多样的，是母体、胎盘和胎儿等多因素共同作用的结果，受到遗传、环境和生理因素等的多重影响。目前认为其发病机制包括胎盘慢性缺血缺氧、免疫紊乱、遗传印记、滋养细胞功能障碍、自噬紊乱以及全身过度炎症反应等。 长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)是指长度超过200个核苷酸的RNA,它们通常是不参与蛋白的编码，但是其可作为潜在的调节因素参与疾病的发生。多种lncRNA通过改变基因表达和干扰信号通路等途径来调控滋养细胞的功能，参与PE的发生。核富集丰度转录本1(NuclearEnrichedAbundantTranscript1,NEAT1)是核旁斑的重要组成部分，lncRNANEAT1可调控肿瘤细胞的生物学功能及化学抗性，参与肿瘤的发生发展。因滋养细胞与肿瘤细胞在细胞功能上的相似性，lncRNANEAT1在PE中的作用被关注，但其具体作用机制尚不明确。 炎症反应是机体应对危险刺激的一种保护性免疫反应，炎性小体是其重要因素，其中最具特征的是NLRP3炎性小体。过度激活的NLRP3炎性小体可导致多种妊娠炎症性疾病和病理妊娠的发生，如复发性流产、绒毛膜羊膜炎、早产、PE和妊娠期糖尿病等。 自噬是是细胞在不良生存环境下，自我消化和分解胞内的一些蛋白质，从而保证细胞存活的一种自我保护机制。自噬障碍也会导致多种妊娠相关性疾病的发生，如PE、宫内生长受限和妊娠期糖尿病等。PE具有的缺血缺氧、氧化应激和炎症反应等都与自噬密切相关。 研究表明，lncRNANEAT1可通过调节NLRP3炎性小体和自噬在恶性肿瘤、神经退行性疾病和心血管疾病等的发生发展中起到重要作用，而炎性小体与自噬之间也存在复杂的相互调节作用，参与多种疾病的发生。因此我们推测,在PE中也许亦存在lncRNANEAT1对NLRP3炎性小体或自噬的调控。本研究通过临床标本检测、细胞实验及动物实验三个层面，探讨lncRNANEAT1对NLRP3炎性小体和自噬的调控，以及它们对细胞功能和动物表型的影响，阐明lncRNANEAT1、NLRP3炎性小体和自噬在PE中发挥的作用，为研究PE的发病机制及临床治疗提供新的思路及理论依据。 第一部分子痫前期胎盘lncRNANEAT1、NLRP3炎性小体及自噬的表达 研究目的 探究lncRNANEAT1、NLRP3炎性小体及自噬在正常妊娠和PE孕妇胎盘中的表达。 研究方法 选择2018年1月至2018年12月剖宫产分娩的孕妇作为研究对象，其中PE组30例，同期分娩的正常妊娠组30例。实时定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction,qRT-PCR)法检测胎盘lncRNANEAT1的表达。免疫组化法检测NLRP3炎性小体和自噬蛋白的定位表达。WesternBlot法检测NLRP3炎性小体和自噬蛋白的表达。对lncRNANEAT1进行生物信息学分析，预测其靶基因，并利用富集分析探讨其可能的作用机制。 研究结果 1、qRT-PCR检测显示，PE组胎盘lncRNANEAT1的表达明显高于正常妊娠组。而且，lncRNANEAT1的相对表达水平与血压呈正相关。 2、免疫组化检测显示，胎盘中NLRP3、Caspase-1、LC3和P62主要表达在滋养细胞的胞质中，PE组NLRP3、Caspase-1和LC3的表达明显强于正常妊娠组，而P62的表达明显弱于正常妊娠组。 3、Westernblot检测显示,与正常妊娠组相比,PE组胎盘NLRP3、Caspase-1、Beclin-1、LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达明显升高，而P62的表达明显降低。 4、CeRNA和PPI蛋白互作网络显示NLRP3是lncRNANEAT1的靶基因之一，且两者的关联强度较好。GO及KEGG/PANTHER富集分析显示lncRNANEAT1靶基因富集的部分生物过程和信号通路与PE密切相关，如缺氧、炎症、自噬及氧化应激等。 研究结论: 1、PE胎盘中lncRNANEAT1的表达明显升高，NLRP3炎性小体明显激活，而自噬明显增强。 2、LncRNANEAT1的靶基因富集的部分生物过程和信号通路与PE密切相关，而NLRP3是lncRNANEAT1的靶基因之一。 3、胎盘中lncRNANEAT1表达上调、NLRP3炎性小体激活以及自噬增强与PE的发病有关。 第二部分缺氧环境下滋养细胞lncRNANEAT1、NLRP3炎性小体和自噬的表达以及对细胞功能的影响 研究目的 探究不同缺氧时间下JEG-3滋养细胞中lncRNANEAT1、NLRP3炎性小体及自噬的表达情况，以及对细胞功能的影响。 研究方法 缺氧在PE的发生发展中起到重要作用，以JEG-3滋养细胞系为研究对象，将JEG-3细胞在缺氧（2％O2,93％N2,5％CO2）环境下培养建立滋养细胞缺氧模型，即为缺氧组（Hypoxia）,并根据缺氧时间分为12h组、24h组和48h组;常氧对照组（Normoxia）是将细胞置于常氧环境（20％O2,75％N2,5％CO2）下培养。qRT-PCR法检测各组细胞lncRNANEAT1和NLRP3mRNA的表达。WesternBlot法检测NLRP3炎性小体、炎症因子和自噬蛋白的表达。流式细胞法（AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡法）、MTT法和Transwell小室法检测细胞的凋亡、增殖和侵袭。 研究结果 1、缺氧组JEG-3细胞lncRNANEAT1和NLRP3mRNA的表达较常氧组明显增加,且随缺氧时间延长，其表达水平呈增加趋势。 2、与常氧组相比，缺氧组JEG-3细胞NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、Beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显增加，且随缺氧时间延长表达递增，而P62的表达明显降低，且随缺氧时间延长表达递减。 3、与常氧组相比，缺氧24h和48h组JEG-3细胞的凋亡明显增加，缺氧48h组的凋亡水平最高。而缺氧12h组的细胞凋亡较常氧组有所降低。 4、与常氧组相比，缺氧24h和48h组JEG-3细胞的增殖明显降低，缺氧48h组降低尤为显著。而缺氧12h组的细胞增殖与常氧组相比无明显差异。 5、与常氧组相比，缺氧24h和48h组JEG-3细胞的侵袭明显降低，缺氧48h组降低更显著。而缺氧12h组的细胞侵袭较常氧组增强。 研究结论 1、缺氧环境下，滋养细胞lncRNANEAT1的表达明显增加，NLRP3炎性小体以及自噬明显激活，而这些改变与缺氧时间呈正相关。 2、短期缺氧（缺氧12h）可促进滋养细胞的侵袭，抑制细胞凋亡;而长期缺氧（缺氧24h和48h）可抑制滋养细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡，介导细胞的损伤。 3、长期缺氧可能通过调控lncRNANEAT1、NLRP3炎性小体和自噬的表达，影响滋养细胞功能，参与PE的发生。 第三部分缺氧环境下lncRNANEAT1对NLRP3炎性小体和自噬的调控及对滋养细胞功能的影响 研究目的 探究缺氧环境下干扰JEG-3细胞lncRNANEAT1的表达对NLRP3炎性小体、自噬以及滋养细胞功能的影响，进一步探究抑制NLRP3和自噬后对相关因子的表达及滋养细胞功能的影响，明确lncRNANEAT1、NLRP3炎性小体和自噬之间的调控在PE中可能的作用机制。 研究方法 JEG-3细胞缺氧处理24h建立PE体外细胞模型，小干扰RNA(si-NEAT1)转染细胞干扰其lncRNANEAT1的表达，NLRP3过表达质粒(pcDNA-NLRP3)转染细胞使其高表达NLRP3,同时转染它们的阴性对照(si-NC和pcDNA-NC),qRT-PCR验证转染效率。qRT-PCR检测各组细胞(Normoxia、Hypoxia、Hypoxia+si-NC、Hypoxia+si-NEAT1、Hypoxia+si-NEAT1+pcDNA-NC和Hypoxia+si-NEAT1+pcDNA-NLRP3)NLRP3炎性小体相关因子的mRNA表达。WesternBlot法检测NLRP3炎性小体、炎症因子和自噬蛋白的表达。免疫荧光检测LC3的表达。流式细胞法和Transwell小室法检测细胞的凋亡及侵袭。使用自噬抑制剂3-MA和NLRP3抑制剂MCC950抑制自噬和NLRP3,上述方法检测各组JEG-3细胞(Normoxia、Hypoxia、Hypoxia+3-MA、Hypoxia+MCC950和Hypoxia+3-MA+MCC950)NLRP3炎性小体和自噬的表达，以及细胞的凋亡和侵袭。 研究结果 1、缺氧环境下，si-NEAT1干扰JEG-3细胞的NEAT1表达后，NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、Beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显降低，P62的表达明显增加。而进一步高表达NLRP3后，NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、Beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显增加，P62的表达明显降低。 2、缺氧环境下，si-NEAT1干扰JEG-3细胞的NEAT1表达后，细胞的凋亡明显降低，侵袭明显增强。而pcDNA-NLRP3进一步高表达NLRP3后，细胞的凋亡明显增加,侵袭明显降低。 3、缺氧环境下，MCC950抑制JEG-3细胞的NLRP3后，NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、Beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显降低，P62的表达明显增加。3-MA抑制自噬后，Beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显降低，P62的表达明显增加，而NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β的表达进一步增加。 4、缺氧环境下，MCC950抑制JEG-3细胞的NLRP3后，细胞的凋亡明显降低，侵袭明显增强。而3-MA抑制自噬后，细胞的凋亡进一步增加，侵袭进一步的降低。 研究结论 1、干扰lncRNANEAT1的表达可抑制缺氧导致的滋养细胞NLRP3炎性小体和自噬的激活，逆转缺氧导致的滋养细胞凋亡的增加和侵袭的减弱，而这些改变可被NLRP3的高表达再次逆转。 2、自噬可随NLRP3炎性小体的激活而增强，随NLRP3炎性小体的抑制而减弱;而抑制自噬可进一步加重缺氧导致的NLRP3炎性小体的激活。 3、NLRP3炎性小体的激活可导致滋养细胞功能的损伤，而抑制自噬可能通过加重NLRP3炎性小体的激活而加重缺氧导致的细胞功能的损伤。 4、上调的LncRNANEAT1可通过调控NLRP3炎性小体和自噬介导滋养细胞功能的损伤，而NLRP3炎性小体和自噬之间也存在相互作用，参与PE的发生发展。 第四部分lncRNANEAT1对子痫前期样小鼠NLRP3炎性小体和自噬的调控及对小鼠表型的影响 研究目的 建立PE小鼠模型，探究lncRNANEAT1对小鼠胎盘中NLRP3炎性小体和自噬的调控以及对小鼠表型和妊娠结局的影响，明确lncRNANEAT1在PE中的作用机制。 研究方法 采用腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）建立子痫前期（PE）小鼠模型，以正常妊娠（Normal）小鼠作为对照组。采用慢病毒sh-NEAT1转染PE小鼠干扰其lncRNANEAT1的表达，转染sh-NC作为其对照组。监测Normal、PE、PE+sh-NC和PE+sh-NEAT1四组小鼠的血压，并收集它们的胎盘、胎仔和肾脏。qRT-PCR法检测小鼠胎盘中lncRNANEAT1和NLRP3炎性小体相关因子mRNA的表达。WesternBlot法检测小鼠胎盘中NLRP3炎性小体、炎症因子和自噬蛋白的表达。免疫荧光检测小鼠胎盘中LC3的表达。HE染色检测小鼠肾脏病理情况。记录胎仔数量及胚胎吸收情况，分别称量胎仔和胎盘重量。 研究结果 1、PE组小鼠胎盘中lncRNANEAT1的表达明显高于Normal组，而PE+sh-NEAT1组的lncRNANEAT1表达较PE+sh-NC组明显降低。 2、LPS注射前，Normal、PE、PE+sh-NC和PE+sh-NEAT1四组间的血压无明显差异。LPS注射后，PE组和PE+sh-NC组的血压逐渐升高，且明显高于Normal组。而干扰NEAT1后，PE+sh-NEAT1组的血压较PE+sh-NC组明显下降。 3、PE组小鼠的肾脏表现为肾小球肿胀，内皮细胞增生，毛细血管腔狭窄及肾小囊闭塞。而干扰NEAT1后，PE+sh-NEAT1组小鼠的肾脏病理学改变得到改善。 4、PE组的胚胎吸收率明显高于Normal组,而胎仔和胎盘重量明显低于Normal组,。干扰NEAT1后，PE+sh-NEAT1组的胚胎吸收率较PE+sh-NC组明显降低，而胎仔和胎盘重量明显高于PE+sh-NC组。 5、PE组小鼠胎盘中NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β的表达明显增加，而干扰NEAT1后，NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β的表达明显降低。 6、PE组小鼠胎盘中Beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显增加，P62的表达明显降低，而干扰NEAT1后，Beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显降低，P62的表达明显增加。 研究结论 1、LPS诱导的PE小鼠的胎盘中lncRNANEAT1的表达上调，NLRP3炎性小体是激活的，且自噬是增强的。 2、干扰lncRNANEAT1表达可抑制PE小鼠胎盘中NLRP3炎性小体和自噬的激活,改善PE小鼠的高血压、肾脏损伤及妊娠结局。 3、LncRNANEAT1的上调参与PE的发生发展，而干扰lncRNANEAT1可通过调控NLRP3炎性小体和自噬改善小鼠PE样表型及妊娠结局，lncRNANEAT1有望成为治疗PE的潜在靶点。
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