摘要
近年来，随着抗菌素耐药性(Antimicrobialresistance,AMR)的急剧增加，细菌病防治变得愈发困难。噬菌体具有天然的杀菌能力，能特异性感染并裂解细菌，作为一种潜在的动物新型替抗产品，正重新受到人们关注。然而，在噬菌体治疗过程中，细菌会对噬菌体产生耐受，从而影响治疗效果。考虑到解决耐药病原菌对噬菌体耐受能够改善治疗结果，本研究拟基于噬菌体的分离，鉴定和表征，同时采用转座子测序(Tn5-Seq)和表型验证的方法，全面筛选和解析噬菌体耐受和敏感有关的遗传决定因子，将有助于临床中选用合适的噬菌体制剂和小分子抑制剂组合来治疗特定病原菌的感染。 本研究首先以模式大肠杆菌C600为宿主菌，在猪场污水中分离到了一株高裂解型噬菌体AH67C600_Q5。对其进行生物学特性研究，透射电镜确定其为短尾噬菌体科，最佳感染复数为0.1,一步生长曲线的结果显示该噬菌体的潜伏期约在30min,爆发期约50min。该噬菌体还表现出良好的稳定性，在温度稳定性试验中，其在4～50℃之间保持良好的活性，pH稳定性试验显示其在pH值6～8之间弱碱环境下高度耐受。随后，对噬菌体基因组进行了解析，该噬菌体的核酸类型为双链DNA,全基因组全长为38824bp,GC含量为48.38％,编码了50个CDS,且该噬菌体不含溶源及毒力相关基因;基于末端酶大亚基构建进化树，其与肠杆菌噬菌体CICC80001亲缘关系较近，为T7-like噬菌体。 有研究表明T4-like和T7-like噬菌体是环境中最为流行的两类双链DNA裂解型噬菌体，为了全面筛选和解析噬菌体耐受相关的遗传决定因子，我们将本论文表征的T7-like噬菌体AH67C600_Q5和团队前期表征的T4-like噬菌体AH67C600_Q9用于构建大肠杆菌C600的Tn5转座子突变文库。结果显示，在两种噬菌体压力下发现了六个共同参与与易感性相关的基因(qseE,rstB,wbbL,mltC,uxaA和entS)，其中编码双组分系统传感器组氨酸激酶(HKs)的两个基因qseE和rstB，即QseE/QseF系统和RstB/RstA系统，显示插入数量的显著增加。同时，发现九个共同参与与噬菌体耐受相关的基因(ydhJ，ompW,glnP,mutM,yeaO,menC,pepB,yraQ和sulA),其中编码分泌蛋白的基因ydhJ和编码外膜蛋白的基因ompW显示插入数量显著减少。进一步GO分析表明这些敏感和耐受基因主要富集在生物过程中的细胞和代谢过程。为了验证Tn-Seq结果的准确性，我们挑选其中敏感基因qseE进行表型验证，该基因编码双组分系统传感器组氨酸激酶QseE/QseF系统，对该基因进行敲除并构建缺失株，通过噬菌体滴板法进行表型验证，结果显示较野生株相比，噬菌体对缺失株的裂解能力有所下降。 综上，本研究分离得到一株特异高裂解型T7-like噬菌体，对其生物学特性和基因组分析显示其可作为潜在的噬菌体治疗主体用于临床。考虑到解析耐药病原菌对噬菌体耐受和敏感有关的遗传决定因子能够改善治疗结果，本研究选择裂解性T4-like噬菌体AH67C600_Q9和T7-like噬菌体AH67C600_Q5分别感染模式大肠杆菌C600突变文库，并利用Tn-Seq鉴定了与噬菌体易感性和抵抗性相关的基因，随后通过对目标基因进行敲除构建缺失株和噬菌体滴板实验验证了方法的有效性，表明Tn5转座子突变文库能够作为一种有效的筛选方法用于鉴定噬菌体耐受和敏感有关的遗传决定基因。同时，通过对这些基因的认识，如果进一步解析其背后的功能，以此筛选能够辅助噬菌体治疗的潜在佐剂，将极大的改善噬菌体治疗效果。
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