摘要
背景:急性胰腺炎(Acutepancreatitis,AP)是以局部胰腺损伤为主要特征的临床非炎症感染性疾病，早期以保守治疗为主，一旦控制不佳，损伤的腺泡细胞破裂释放损伤内容物(酶原颗粒，氧化应激产物等)连同大量炎症释放因子，引起全身炎症反应甚至多器官功能障碍，称为重症急性胰腺炎。临床病死率居高不下，从基础研究中寻求新的治疗靶点进行临床应用转化，保护并延缓AP的疾病进展显得至关重要。大部分AP患者均为轻症急性胰腺炎(Mildacutepancreatitis,MAP),通常只需住院治疗几周便可痊愈，病死率低。少部分患者(15％-20％)可能造成胰腺周围组织或远端脏器损伤，接着进展为重症急性胰腺炎(Severeacutepancreatitis,SAP),SAP病死率极高，医疗费用也是治疗MAP的数倍，给医疗服务水平带去了极大的挑战。 中性粒细胞是人体的第一道防线，在人体发生炎症时，中性粒细胞迅速被募集到炎症处，释放中性粒细胞胞外捕获网(Neutrophilextracellulartraps,NETs)可以有效结合，吞噬，杀死微生物。然而，除了在抗微生物先天免疫中发挥核心作用外，NETs已被证明在许多感染性和非感染性疾病的病理生理学中发挥有害作用。已有研究证明，NETs在AP进展为SAP时有一定促进作用。 CD177编码的中性粒细胞膜糖蛋白(gp)NB1,属于白细胞抗原6(Ly-6)超基因家族。CD177与β2整合素结合并识别血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM-1),表明其在中性粒细胞迁移中的作用。据报道，CD177在一些炎症性疾病的发生中起着关键作用，如关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、病原体诱导的结肠炎和炎症性肠病(IBD);然而，CD177在调节NETs形成和发展在AP中的功能仍不明确。此外，至今尚无研究调查了重组人CD177蛋白(rhCD177)在减轻炎症反应和AP发病机制方面的作用。 本研究旨在研究CD177在AP病人外周血的表达情况以及对AP发病的作用，这将为日后的对SAP的预测和临床靶向治疗提供理论参考。 目的:1.检测CD177+中性粒细胞在正常人、AP患者外周血中性粒细胞中的占比;2.研究rhCD177对体外12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(PMA)诱导的NETs模型的影响;3.研究rhCD177对Cae(Caerulein,雨蛙素)诱导的AP小鼠模型的影响。 方法:1.收集急性胰腺炎患者和健康人外周血，用梯度离心法提取外周血中粒细胞的部分，利用流式细胞术(FCM)检测CD45+、CD11b+、CD16+、CD177+细胞在外周血中的表达水平;2.提取小鼠的腿骨骨髓细胞，利用PMA构建体外NETs模型，随后加入rhCD177,通过流式细胞术和免疫荧光观察NETs形成情况。3.通过ELISA检测细胞上清里的炎症因子水平，观察rhCD177对NETs的影响。4.提取上述细胞的蛋白，进行WesternBlot(WB),分析加入rhCD177后，NETs标志物PAD4的表达情况。5.利用Cae构建AP小鼠模型:将实验动物分为正常对照组，AP模型组和治疗组。留取小鼠血清进行血清酶学水平检测。6.提取胰腺组织进行固定脱水，制作HE染色的病理切片进行病理评分，观察rhCD177对AP病理的影响。7.同时对胰腺组织和肺组织进行免疫组化染色(IHC),观察组织内巨噬细胞和中性粒浸润变化;8.提取小鼠外周血和胰腺组织免疫细胞，通过流式细胞术检测胰腺组织中免疫细胞浸润情况。9.提取胰腺组织蛋白，进行WB,观察NETs标志物PAD4的表达变化情况。 结果:1.使用流式细胞学检测到AP患者外周血PBMC中CD45+、CD11b+、CD16+、CD177+细胞占比升高(P＜0.001)并与疾病严重程度呈正比。2.使用流式细胞学和荧光免疫发现:与对照组相比，PMA诱导的NETs模型组的ROS(reactiveoxygenspecies,活性氧)和MPO(myeloperoxidase,髓过氧化物酶)生成水平明显增加,rhCD177可抑制MPO和ROS的水平，从而保护急性胰腺炎。3.通过ELISA检测发现，加入rhCD177后，细胞上清中的TNF-α和IL-6表达水平明显下降(P＜0.01)。4.通过WB结果发现，相比于模型组，应用rhCD177后，PAD4的表达明显下降(P＜0.01)。5.通过HE染色和血清淀粉酶脂肪酶水平检测发现:rhCD177可缓解小鼠急性胰腺炎疾病的严重程度。rhCD177能显著保护急性胰腺炎胰腺组织损伤，降低血清淀粉酶和脂肪酶的水平(P＜0.001)。6.通过IHC,免疫荧光发现:Cae诱导的AP模型小鼠的胰腺组织和肺组织中免疫细胞浸润增加;外源性补充rhCD177可以有效改善炎症表现、中性粒细胞和巨噬细胞浸润明显减少(P＜0.01)。7.提取外周血和胰腺组织免疫细胞后，通过流式细胞术发现:在使用rhCD177后，外周血和胰腺组织中免疫细胞浸润明显下降(P＜0.01)。8.提取胰腺组织蛋白发现:治疗组的蛋白PAD4表达量明显下降(P＜0.01)。 结论:CD177+中性粒细胞的水平在AP病人外周血的表达升高，并随着疾病的严重程度上升;rhCD177可以通过抑制NETs来对AP产生保护作用并缓解AP引起的肺部损伤。这预示着CD177或将成为一种预防或抑制AP加重的潜在治疗策略。
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