摘要
拟态弧菌(Vibriomimicus)是一种重要的人兽共患病原菌，广泛分布于河水、海水和水产品中，在20℃到37℃的低盐环境下生长良好。拟态弧菌作为水产养殖领域中一种新兴食源性病原菌，其多重抗生素耐药性菌株呈现逐渐增多的趋势。因此，分离筛选拟态弧菌烈性噬菌体并从基因层面阐释抑菌机制，对于预防全球范围内由拟态弧菌引起的水产养殖业的经济损失十分关键。本研究以拟态弧菌CICC21613为宿主菌，成功筛选到一株具有跨弧菌属裂解能力的噬菌体Vmp-1,并对其生理学特性、基因组特征、抑菌效果及抑菌机理进行了系统的研究，具体内容如下: (1)对拟态弧菌CICC21613裂解性噬菌体进行筛选分离及生理学特性研究。从扬州农贸市场污水混样中分离得到一株烈性噬菌体,命名为Vmp-1。透射电镜结果显示，噬菌体Vmp-1属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。其最佳感染复数(multiplocityofinfection,MOI)为0.001,并具有跨三种弧菌属的裂解能力。一步生长曲线结果显示，Vmp-1潜伏期为20min,裂解期为100min,裂解量达到83.2PFU/cell。稳定性试验结果显示Vmp-1能在50℃,pH3.0-12.0范围内保持稳定裂解活性。 (2)对噬菌体Vmp-1的全基因组进行分析。Vmp-1基因组的全长为43,312bp,GC含量为49.5％。按基因组别进行功能注释，包括5个DNA代谢相关基因，1个RNA聚合酶相关基因，11个噬菌体结构蛋白基因，3个裂解基因，4个其他功能基因，以及17个假设基因。Vmp-1不携带任何已知毒力基因。在NCBI数据库中对噬菌体Vmp-1全基因组进行Blast分析，发现拟态弧菌噬菌体Vmp-1与副溶血性弧菌噬菌体HA5(GenBank:OK585159.1)同源性最高为95.96％,与拟态弧菌噬菌体OY1(GenBank:OM799543.1)同源性为94.82％。未知功能蛋白ORF42与HA5同源性为96.39％,与OY1同源性为83.94％,可能在噬菌体进化中发挥重要作用。 (3)利用培养基模型研究拟态弧菌噬菌体Vmp-1的抑菌效果。噬菌体Vmp-1对拟态弧菌抑膜结果显示，当MOI大于1时，可以完全抑制拟态弧菌生物膜的生成;当MOI小于1时，对生物膜的抑制效果随着噬菌体剂量的增加而增强。不同MOI下Vmp-1的抑菌效果良好，但在MOI=0.0001混合培养4h时OD600nm值升高，但平板涂布活菌数下降，推测可能存在活的非可培养(VBNC)状态的细菌。以弧菌dnaJ基因合成qPCR检测拟态弧菌引物，引物扩增片段为177bp。在噬菌体感染的前3h,感染组与对照组平板计数与qPCR检测结果基本一致。在感染4h后，噬菌体感染组的qPCR检测与平板计数之间出现了2.35LgCFU/mL的差别，证实在噬菌体抑菌过程中存在VBNC状态细胞。实验将噬菌体与超声波技术联合抑菌，结果显示超声波处理减菌达到1.00LgCFU/mL,在MOI=1条件下减菌效果最大达到3.15LgCFU/mL,而当噬菌体联合超声波的最大减菌效果达到5.33LgCFU/mL。 （4）进行噬菌体Vmp-1稳定不敏感菌株的筛选，生理学特性及转录组学研究。生理学特性研究结果表明，相较于亲本菌株，S-2菌株的形态、生长曲线基本一致;50℃时耐热能力及对超声波的耐受能力显著提高;成膜能力、噬菌体吸附能力及pH为5.0时生长能力都明显降低。转录组结果显示共有16个转录水平上调基因，35个转录水平下调基因。其中gene-Y058_RS10010（噬菌体休克蛋白PspA）表达水平的上调与噬菌体的感染有关，并影响超声波耐受性;gene-Y058_RS01340（OmpA家族蛋白）表达水平的下调影响噬菌体的吸附;gene-Y058_RS01390（菌毛组装蛋白N-末端结构域蛋白）表达水平的下调影响菌株成膜能力。
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