摘要
龙须菜是一种经济型红藻，主要活性成分为多糖，具有降血糖、降血压、降血脂和抗肿瘤等生理功能，呈现出较高的保健和营养价值。然而，龙须菜多糖分子量和粘度较大，且结构复杂，不利于多糖进一步的应用。采用过氧化氢联合维生素C(H2O2-Vc)方法进行降解，探索降解前后多糖的结构变化，解析多糖糖苷键的构型和连接方式，并结合体外酶抑制率、细胞和动物实验探索其调节糖脂代谢的活性和作用机制，主要的研究内容和结果如下: 1、以龙须菜为原料，采用热水醇沉法提取多糖，采用H2O2-Vc(摩尔比1∶1)降解多糖，通过单因素和响应面优化实验得到最优降解方案为:H2O2-Vc浓度为18.7mM,反应时间为0.5h,反应温度为56℃。 2、采用最优方案降解多糖后得到龙须菜多糖降解产物(GLP-HV),以GLP(未降解处理的龙须菜多糖)、GLP-H(H2O2单独降解)和GLP-V(Vc单独降解)作为对照，研究多糖降解前后结构特性的变化。通过高效液相色谱法测定单糖组成，得到龙须菜多糖降解前后的单糖均主要为葡萄糖和半乳糖。通过凝胶渗透色谱法测定分子量，得到GLP、GLP-HV、GLP-H和GLP-V四种多糖的平均分子量分别为1478、16、1330和1001kDa。由激光粒度仪检测到GLP、GLP-HV、GLP-H和GLP-V的平均粒径分别为258.05±18.82、85.14±1.42、118.64±5.41和133.53±5.55μm。通过色差仪和粘度计分别测定H2O2-Vc对多糖色泽和粘度的影响，结果表明GLP-HV的色泽变亮、粘度变小。采用傅立叶变换红外光谱仪分析四种多糖的官能团，结果表明H2O2-Vc降解没有改变多糖的官能团种类。通过扫描电子显微镜和原子力显微镜分析多糖的微观结构，结果发现降解后的多糖结构破碎，颗粒变小。结合气质联用仪和核磁共振波谱仪共同探索GLP-HV的糖苷键构型和连接方式，结果表明GLP-HV主要是由→4)-α-D-Glcp-(1→、→3)-β-D-Galp-(1→与少量的→4,6)-α-D-(2-O-Me)-Glcp-(1→相互连接形成主链，支链由β-D-Glcp-(1→连接在糖残基→4,6)-α-D-(2-O-Me)-Glcp-(1→的O-4位置构成。 3、通过体外自由基清除率实验，表明四种多糖清除自由基的能力依次为GLP-HV＞GLP-H、GLP-V＞GLP,GLP-HV对ABTS+、铁离子、DPPH和超氧自由基的半抑制浓度分别为9.62±0.35、4.97±0.18、23.85±1.78和3.56±0.0028mg/mL。通过细胞实验可知GLP-HV显著增强了高糖高脂细胞的抗氧化酶活性,减弱活性氧自由基和钙离子强度，缓解细胞的氧化损伤(p＜0.05)。RT-PCR实验显示，GLP-HV显著上调Nrf-2、HO-1、NQO-1和ZO-1基因，下调Keap-1基因(p＜0.05)。相关性分析揭示了GLP-HV通过Nrf-2信号通路调控细胞的氧化应激，从而改善细胞的糖脂代谢。 4、通过酶的抑制率实验，得到GLP-HV对α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶和胆固醇酯酶的半抑制浓度分别为0.265±0.03、2.92±0.28和5.81±0.46mg/mL。通过酶的动力学实验可知，GLP-HV对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制类型为竞争型和非竞争型混合，对胆固醇酯酶的抑制类型为非竞争型。通过荧光光谱分析，得到GLP-HV对α-葡萄糖苷酶和胆固醇酯酶荧光具有动态猝灭作用，对胰脂肪酶荧光具有静态猝灭作用。这些结果表明，GLP-HV具有显著的体外调节糖脂代谢作用。 5、细胞实验表明，GLP-HV显著降低高糖高脂细胞的TC、TG、LDL-C、FFA、LPL、LPO、瘦素、MDA和LDH含量，提高HDL-C、T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX和糖原含量(p＜0.05)。另外，GLP-HV明显增加了细胞的葡萄糖消耗量、产量和吸收，减少活性氧自由基和钙离子含量(p＜0.05),改善细胞的糖脂代谢和氧化损伤。RT-PCR实验表明，GLP-HV上调IR/IRS-2/PI3k/Akt/Glut4信号通路上相关因子的基因水平，显著上调AMPK和HSL基因水平，下调SREBP-1c、ACC和FAS基因水平(p＜0.05)。蛋白免疫印迹实验表明，GLP-HV上调或下调IR/IRS-2/PI3k/Akt/Glut4和PPAR-γ/AMPK信号通路上相关因子的蛋白水平。相关性分析表明龙须菜多糖对细胞糖脂代谢的调节活性与其还原糖、3,6-内醚半乳糖、硫酸基和羰基具有正相关性，与分子量和相对粘度呈负相关。并且，龙须菜多糖对细胞的糖脂代谢调节活性与IR/IRS-2/PI3K/Akt/Glut4和PPAR-γ/AMPK信号通路都具有极强的相关性，揭示了这两条信号通路对细胞的糖脂代谢活性具有调控作用。 6、动物实验表明，经过8周GLP-HV喂养，糖脂代谢紊乱小鼠的体重和空腹血糖值显著降低，血清LPO、LPL、TBA、FFA、瘦素、胰岛素和糖化血清蛋白含量也明显下降，脂联素和LDH含量显著升高(p＜0.05)。GLP-HV明显改善小鼠的葡萄糖耐量、胰岛素耐量、血脂水平和氧化应激，降低ALT、AST、BUN和Cr含量，恢复肝脏和肾脏的生理功能。采用HE、PAS和油红O分别对肝脏进行染色，结果表明GLP-HV对小鼠肝脏具有修复作用，对糖原和脂肪累积的情况具有改善作用。RT-PCR和蛋白免疫印迹实验表明，GLP-HV基于IR/IRS-2/PI3k/Akt/Glut4和PPAR-γ/AMPK信号通路调控小鼠的糖脂代谢活性。16SrDNA高通量测序分析结果表明高糖高脂饮食对小鼠的肠道菌群组成和结构有影响，抑制了Firmicutes的增值，促进了Bacteroidetes和Proteobacteria的增值，降低肠道菌群丰度和多样性，而GLP-HV改善了糖脂代谢紊乱小鼠的肠道菌群变化，且物种组成和结构趋向于正常组。
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