摘要
近年来，由于从陆生生物中发现新药越来越困难，研究人员一直在探索新的药源。海洋微生物种类繁多，其代谢产物结构独特，是开发抗菌活性成分的理想材料。细菌素无耐药性，无残留，对部分病原菌有抑制或杀灭作用。目前,在国内外细菌素的分离鉴定的报道中，还未曾见到有关于从红树林根际土壤分离鉴定能产生具有抑菌活性细菌素的芽孢杆菌的研究。为了研究红树植物根际土壤中分离的芽孢杆菌产细菌素的结构及其抑菌活性特征，从广东湛江红树林自然保护区采集50个根际土壤样品，对红树植物根际土壤细菌分离鉴定并测定其抑菌效果。挑选出一株广谱抑菌的芽孢杆菌M15进行其抑菌活性物质发酵条件优化及抑菌效果研究，并进行抗菌蛋白PAM15的分离鉴定及菌株全基因组测序分析。主要研究结果如下: (1)红树植物根际土壤细菌分离鉴定及抑菌活性研究 从广东湛江红树林自然保护区的红树植物根际土壤中分离培养细菌，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和链球菌为指示菌，采用固体琼脂打孔法对红树植物根际细菌进行抑菌活性筛选，对有抗菌活性的菌株进行纯化和总DNA的提取以及分子生物学方法鉴定。结果表明，共从根际土壤中分离得到654株可培养的细菌，有107株菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和链球菌有抑菌活性，占分离菌株的16.4％。其中对金黄色葡萄球抑菌活性最佳的菌株P19和P25的抑菌圈直径为16mm;对大肠杆菌和链球菌抑菌活性最强的菌株M26的抑菌圈直径分别为13mm、16mm;对沙门氏菌抑菌活性最强的菌株P83的抑菌圈为13mm;菌株M36和P31的抑菌谱最广。菌株M15具有广谱的抑菌效果，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌和沙门氏菌抑菌圈直径分别为14mm、9mm、14mm和9mm。有抑菌活性菌株经16SrDNA基因序列鉴定共有4个属，分别是肠杆菌属、芽孢菌属、葡萄球菌属、伯克霍尔德氏菌属。 (2)芽孢杆菌M15发酵条件优化及抑菌效果研究 从分离培养的红树植物根际土壤细菌中筛选一株对病原菌具有广谱拮抗作用的菌株M15进行全基因测序分析，菌株被鉴定为蜡样芽孢杆菌。对菌株M15进行发酵培养条件优化，并观察其抑菌活性物质对酸碱稳定性、温度和蛋白酶稳定性。结果表明:发酵条件为装液量30mL、接种量2％,发酵温度30℃,发酵时间120h时，发酵液的抑菌效果最佳，对大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌抑菌圈直径均为17mm,金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为15mm;发酵培养基pH值小于5.0或者大于6.0时，抑菌活性丧失;菌株M15的发酵液抑菌活性在30℃-60℃较稳定，≥80℃时，发酵液抑菌物质失去活性;抑菌物质对胰蛋白酶不敏感，对木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶E和蛋白酶K敏感。 (3)抗菌蛋白PAM15分离鉴定及细菌全基因组测序分析 对芽孢杆菌M15制备发酵上清液，先加硫酸铵盐析，后通过葡聚糖凝胶层析柱(G75)及两次离子交换柱(梯度洗脱和线性洗脱)分离纯化，纯化后的抗菌蛋白命名为PAM15,最后对抗菌蛋白PAM15进行SDS-PAGE凝胶电泳及质谱测序分析;同时对芽孢杆菌M15全基因组使用SPAdes进行二代测序分析和GO、KEGG、COG和NR数据库进行基因功能注释。结果表明:第二次离子纯化后得到一单峰，经SDS-PAGE和质谱结果表明PAM15是一个分子量为51.26kDa的蛋白。PAM15分子组成及理化参数预测结果表示，分子式为C2272H3644N630O687S15,氨基酸数量为479个，理论等电点是5.91,为亲水性蛋白。芽孢杆菌M15基因组预测得到5535个编码基因，基因序列总长度为5590460bp,GC含量为34.88％;编码基因功能注释得知，17个基因参与抗氧化活性过程，3个基因参与免疫过程;207个基因与细菌素和免疫相关，其中176个是合成ABC型细菌素转运系统的功能基因。
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