摘要
水稻(OryzasativaL.)作为世界上重要的粮食作物之一，是全球约35亿人的主食。在实际生产中，与水分、土地盐碱度、温度等相关的非生物胁迫严重制约着水稻的品质和产量。研究表明RFS(开花和胁迫调控蛋白)在植物响应非生物胁迫中起到重要的作用。但水稻RFS基因功能研究尚未报道。本研究以水稻OsRFS基因为对象，通过生物信息学、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和转基因等技术，克隆并分析了该基因的功能，主要研究结果如下: 1.在水稻基因组数据库(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Osativa_v7_0)通过同源比对得到一个与BdRFS同源性最高(65.8％)的候选基因中，该基因全长为993bp,仅含1个外显子，长度为696bp,5''和3''端的非翻译区分别为91bp和206bp,共编码231个氨基酸，蛋白相对分子质量为24.76kDa。通过蛋白结构分析表明该蛋白在N端和C端分别含1个跨膜结构和3个保守的结构域。通过理化性质分析表明该基因为稳定的亲水性酸性跨膜蛋白，且通过亚细胞预测分析其定位在叶绿体。基于以上特征，我们将该基因命名为OsRFS。 2.利用RT-qPCR技术对OsRFS基因进行非生物胁迫诱导表达分析。结果表明:OsRFS在不同非生物和外源激素胁迫下在地上和根部呈现不同表达变化，其中根的响应比地上部分强烈。OsRFS在脱水和PEG渗透处理下诱导最强烈，根在该胁迫下分别上调75和141倍。同时，OsRFS在ABA和MeJA胁迫下根分别上调2倍和16倍。在PEG渗透和NaCl处理下地上部分分别下调2-20倍和5-16倍。同时，OsRFS在ABA胁迫下地上部分下调2倍但MeJA处理下变化不显著。 3.我们将克隆得到的OsRFS启动子序列(翻译起始密码子(ATG)上游1872bp)构建到GUS表达载体中，并通过农杆菌介导法获得稳定遗传的转基因水稻植株，从而对其进行组织表达定位研究。结果表明:在成熟叶中，叶尖到叶中的表达量逐渐增加。同时，观察到其也在叶片的静脉和维管束高量表达。另外,OsRFS只在根的中柱表达，从根的横切面观察到其集中在韧皮部和木质部表达。 4.我们将克隆得到的OsRFSCDS序列(696bp)构建到过表达载体中并利用CRISPR/Cas9技术构建OsRFS基因敲除载体，通过农杆菌介导法获得了OsRFS过表达植株以及OsRFS的突变体植株。并通过测序和实时荧光定量PCR方法，对这些植株进行确认。对OsRFS转基因植株进行表型鉴定以及测定与抗逆相关的光合色素含量等。结果表明，OsRFS基因敲除突变体的株高矮化且抽穗期提前，其叶绿素含量、花青素含量和POD（过氧化物酶）活性降低，MDA（丙二醛）含量增加。而OsRFS过表达植株分蘖数、叶绿素和花青素含量增加。 综上所述，RFS是一类在植物中高度保守的跨膜蛋白，在多种非生物胁迫下表达发生明显变化。由于OsRFS转基因植株中与抗逆性相关的生理指标显著变化，预示其在响应非生物胁迫时中发挥了重要作用。
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