摘要
[背景] “近端肾小管中心学说”是近几年来糖尿病肾病(diabetickidneydisease,DKD)的研究热点。我们的前期研究也证实，在早期DKD大鼠的肾脏中发现近端肾小管上皮细胞(proximalrenaltubularepithelialcell,PTEC)的凋亡早于肾小球细胞，并且发现了Bim是引起PTEC凋亡的关键靶点。在DKD中，PTEC的损伤机制除凋亡外，还包括上皮间质转化(epithelialtomesenchymaltransition,EMT),而既往研究也已证实，早期靶向抑制近端肾小管发生EMT可以逆转肾小管间质纤维化(tubularinterstitialfibrosis,TIF),保护PTEC。 传统观念一直认为，EMT这一过程能够令PTEC转变成肌成纤维细胞，从而导致TIF的发生。然而，对于肌成纤维细胞的来源是否是PTEC这一观点饱受争议。有学者认为，肾小管上皮细胞在发生EMT的过程中，并未突破基底膜，而是呈现出一种“部分EMT(partialepithelialtomesenchymaltransition,PEMT)”的状态，也就是说肾小管上皮细胞获得了间质细胞的特性及运动表型，但并未完全突破基底膜，转化成肌成纤维细胞。不论是凋亡，亦或是PEMT,他们均是DKD早期近端肾小管细胞损伤的标志性事件。 我们前期致力于研究PTEC在DKD中损伤的分子机制，结果发现Bim是介导近端肾小管上皮细胞凋亡的关键因子，明确了Bim/NFAT2介导的管球交流在DKD中发挥了重要的作用。故，本课题在前期研究的基础上，探讨Bim在介导PTEC凋亡的方向之外是否还参与影响PEMT的发生，进一步完善Bim介导PTEC损伤的调控网络，为防治DKD提供新的思路和方向。 [目的] 1、利用PTEC条件性敲除Bim小鼠构建DKD模型，体内研究干扰Bim表达后对糖尿病肾病近端肾小管上皮细胞PEMT的影响。 2、体外研究明确高糖条件下干扰HK-2细胞中Bim表达后对PEMT的影响。 [方法] 动物实验:构建PTEC条件性敲除Bim小鼠模型(conditionalbimgeneknockout,BimCKO),并与野生型小鼠(未特异性敲除Bim的正常同品系小鼠，wildtype,WT)对比观察。采用琼脂糖凝胶电泳鉴定各组小鼠基因。在上述小鼠的基础上构建DKD模型，在体内明确近端肾小管中Bim的表达对糖尿病肾病PEMT的影响。选取6-8周龄雄性小鼠行单侧右肾切除术，术后1周给予腹腔注射50mg/kg剂量的链脲佐菌素(STZ)连续5天。注射后72h测量血糖，连续两次同一时间段随机血糖≥16.7mmol/L,视为糖尿病造模成功，将上述Bim敲基因小鼠和野生型小鼠分为以下4组:A:野生型对照组(WT+Con);B:野生型DKD组(WT+DKD);C:Bim敲基因对照组(BimCKO+Con);D:Bim敲基因DKD组(BimCKO+DKD),分别于造模前、造模后4周、8周、12周监测小鼠的体重、血糖和24h尿蛋白，于第12周末处死并取材，检测小鼠血尿素氮和血肌酐的水平。通过免疫组化观察Bim在各组小鼠肾脏中的定位及表达情况。HE染色观察肾组织的病理学改变,Masson染色观察肾组织纤维化程度。免疫荧光染色法观察小鼠肾组织中转化生长因子1(TGF-β1)、间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)和上皮细胞标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)相关因子的表达情况。 细胞实验:体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2),使用慢病毒和嘌呤霉素构建沉默Bim稳转细胞系用于后续实验。并采用高糖(40mmol/L)干预的方式诱导HK-2细胞发生PEMT。细胞实验分组如下:A:正糖组(5.5mmol/L,NG);B:高糖组(40mmol/L,HG);C:高糖+阴性对照病毒组(HG+BimshNC);D:高糖+Bim慢病毒组(HG+BimshRNA)。提取细胞总蛋白，通过Westernblot法验证Bim沉默效率。上述细胞分别在不同葡萄糖浓度干预72h的条件下，通过免疫荧光染色法观察各组细胞中间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)和上皮细胞标志物细胞角蛋白(CK-18)的表达情况，以及核转录因子(NFATc1)的核转位情况。Westernblot法检测HK-2细胞中转化生长因子1(TGF-β1)、波形蛋白(Vimentin)和细胞角蛋白(CK-18)相关因子的表达情况。划痕实验、Transwell迁移实验分别用来观察HK-2细胞的横向和纵向迁移能力。其中，划痕实验观察时间采用了24h、48h和72h以便观察HK-2细胞在不同时间点的迁移情况。 [结果] 1、条件性PTEC敲除Bim能够减轻DKD早期肾损伤。 (1)观察小鼠的一般指标和肾功能，结果显示与两组对照组小鼠(WT+Con,BimCKO+Con)相比较，DKD两组小鼠(WT+DKD,BimCKO+DKD)出现体重增加减缓，部分小鼠的体重减轻;糖尿病肾病两组小鼠血糖水平明显高于非糖尿病肾病两组小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）;与WT+Con组小鼠相比，WT+DKD组小鼠的血尿素氮以及尿蛋白水平明显升高;在敲除小鼠Bim基因后,BimCKO+DKD组小鼠的血尿素氮和尿蛋白水平降低，但体重和血糖与WT+DKD组相比无明显差异，说明敲除小鼠Bim基因可以一定程度上改善肾功能损伤。在实验第12周末，我们发现四组小鼠的血清肌酐值水平并未有明显差异，表明肾功能损伤仍处于早期状态。 （2）免疫组化结果显示，在糖尿病肾病小鼠（WT+DKD组）的近端肾小管中可见Bim阳性染色增多，但是肾小球中未见阳染。非糖尿病肾病组小鼠（WT+Con）未见Bim的明显表达。另外PTEC条件性敲除Bim基因的两组小鼠（BimCKO+Con和BimCKO+DKD）肾组织中均未见Bim表达，证实Bim敲除成功。 （3）HE染色结果显示非糖尿病肾病两组小鼠肾组织无明显病变;糖尿病肾病组小鼠肾小球体积明显肥大，在Bim敲基因小鼠中上述病变有所缓解。另外，Masson染色结果显示，WT+DKD组小鼠肾组织中可见明显的蓝色胶原纤维沉积,以上结果证实敲除Bim后的小鼠能够改善DKD带来的肾损伤。 2、条件性PTEC敲除Bim能够抑制糖尿病肾病PEMT。 动物组织的免疫荧光染色结果显示，相较于WT+Con组，WT+DKD组小鼠肾组织可见vimentin和TGF-β1表达增多，而E-cad表达降低，提示糖尿病肾病组小鼠出现PEMT的表现。然而，敲除Bim后能够逆转上述表现，在BimCKO+DKD肾组织中vimentin和TGF-β1表达减少，E-cad表达增多，证实在动物肾组织中条件性PTEC靶向敲除Bim基因可以抑制糖尿病肾病PEMT。 3、下调HK-2细胞中Bim的表达能够抑制高糖诱导的PEMT,降低细胞的迁移能力，抑制NFATc1核转位。 首先，通过Westernblot结果证实，与转染阴性对照病毒组（BimshNC）相比较，转染Bim慢病毒组（BimshRNA）细胞中Bim蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,证实HK-2细胞中Bim敲降成功，利用敲降成功的细胞系进行后续的体外实验。细胞免疫荧光染色结果显示，经高糖干预后的HK-2细胞内vimentin的表达水平显著增加，而CK-18的表达水平显著减少。此外，Westernblot结果显示，与HG组相比，HG+BimshRNA组细胞中TGF-β1和vimentin的蛋白水平表达减少（P＜0.05）,而CK-18蛋白水平表达增多（P＜0.05）,与细胞免疫荧光的结果一致。证实了下调HK-2细胞中Bim表达可以抑制高糖诱导的细胞PEMT。最后，划痕实验和迁移实验结果显示，与HG组相比，HG+BimshRNA组细胞的迁移能力明显下降（P＜0.05）,抑制Bim表达可以降低高糖条件下HK-2细胞的迁移能力。最后，还观察到高糖环境下HK-2细胞中NFATc1核转位增加，干扰Bim表达后可以抑制高糖干预下HK-2细胞中NFATc1的核转位。 [结论] 1、体内条件性PTEC敲除Bim能够降低小鼠的血尿素氮和尿蛋白水平，减轻DKD早期肾功能损伤，抑制糖尿病肾病PEMT水平。 2、体外下调HK-2细胞中Bim表达可以抑制高糖诱导的细胞PEMT,抑制细胞迁移能力，并且抑制Bim表达可以抑制HK-2细胞中NFATc1核转位。
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