摘要
N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine)是所有高等真核生物mRNA中最常见的可逆表观遗传RNA修饰，随着甲基化检测水平的不断提高以及检测方法的不断完善，RNA甲基化成为近年来的研究热点。研究证实，m6A调节mRNA剪接、半衰期、稳定性和翻译，对基因表达调控和细胞功能有着重要的影响。目前关于m6A的研究已经在人、植物和酵母中进行，哺乳动物仅见于猪、牛以及绒山羊等，但尚未见奶山羊RNAm6A甲基化修饰图谱的报道。 本研究以3只崂山奶山羊在泌乳初期(产后20天)和泌乳高峰期(产后90天)两个泌乳时期的乳腺组织为研究材料，运用m6A修饰的免疫共沉淀测序(MethylatedRNAImmunoprecipitationwithNextGenerationSequencing,MeRIP-seq)和转录组测序(RNAsequencing,RNA-seq)技术，通过对测序数据质量检测，序列比对，组间m6A峰分析以及motif特征分析等过程，鉴定奶山羊泌乳初期和高峰期乳腺发育以及泌乳过程中具有m6A修饰的关键基因;通过对MeRIP-seq和RNA-seq数据的联合分析，找出差异基因(DifferentExpressionGenes,DEGs)与差异甲基化基因(DifferentMethylatedGenes,DMGs)的共有基因，采用GO注释和KEGG通路富集分析，筛选出与乳腺发育与泌乳相关、免疫相关以及代谢相关的基因，构建调控网络并筛选出核心基因，进而对乳腺发育与泌乳过程有更深入的了解。主要研究结果如下: 1.泌乳初期和高峰期乳腺组织广泛发生m6A甲基化，分别存在2,476和1,451个甲基化修饰位点、关联2,260和1,355个表达基因。m6A峰均明显富集在3''非翻译区和终止密码子区，m6A峰区域最常见的基序为GGACT和AAACA。 2.通过MeRIP-seq,在泌乳初期和泌乳高峰期分别获得165,695,678和159,511,700个cleanreads,分别占原始序列读数的99.24％和99.2％。共鉴定出3,927个m6A甲基化位点，按照FDR＜0.05且|log2FC|＞1筛选标准，筛选出725个显著差异peak,其中泌乳高峰期有112个peak上调，613个peak下调。差异甲基化基因GO注释结果集中富集在细胞、器官和细胞器、生物调控、结合和催化活性等;KEGG分析结果显示泌乳相关基因主要富集在MAPK信号通路、NF-κB信号通路、紧密连接信号通路、刺猬信号通路和凋亡等，免疫相关基因主要富集在Th1和Th2细胞分化、T细胞受体信号通路和B细胞受体信号通路等，代谢相关基因主要富集在氨基酸、运输和分解代谢中。 3.通过RNA-seq,在泌乳初期和高峰期分别获得152,341,796和137,170,868个cleanreads,分别占原始序列读数的97.44％和97.9％。共鉴定出21,518个基因，通过FDR＜0.05且|log2FC|＞1筛选得到的758个差异表达基因中，泌乳高峰期有228个基因上调，530个基因下调。这些显著差异基因主要富集在与乳腺发育及泌乳相关的细胞黏附、生长与凋亡等通路;与免疫相关的抗原处理和呈递、NOD样受体信号途径、造血细胞谱和IgA肠道免疫网络等通路;与代谢相关的吞噬体和溶酶体等通路。 4.MeRIP-seq和RNA-seq数据的关联性分析结果显示，m6A与基因表达量之间呈负相关，但有m6A修饰的mRNA整体表达量高于没有m6A修饰的mRNA。九象限图分析结果显示19个甲基化基因存在于转录组中，且有15个基因在差异m6A修饰基因中下调，其中有5个基因与乳腺发育和泌乳相关，2个基因与免疫及免疫疾病相关，3个与代谢以及代谢疾病相关。 5.泌乳初期m6A峰、泌乳高峰期m6A峰以及差异表达基因三部分相互联合分析中鉴定出共有差异基因34个。GO注释结果显示差异基因主要富集在细胞过程、生物过程的调控、单细胞生物过程、细胞生长过程、结合和催化活性等;KEGG富集通路主要有与乳腺发育相关的肌动蛋白细胞骨架的调节、细胞粘附分子和细胞凋亡等，代谢相关的噬菌体、氨基酸代谢和嘌呤代谢等，免疫相关的抗原处理和呈递以及Th1和Th2细胞分化等。 6.乳腺发育与泌乳调控网络结果显示，核心基因为HARS、JUN和EGFR;免疫调控网络显示，其核心基因为RIPK1、BIRC2和BIRC5;代谢调控网络显示，其核心基因为PLCG1、PLCE1和PLCB1。 7.通过对泌乳、免疫和代谢调控网络核心基因进行m6A位点预测显示，存在多个高置信度位点，置信度在99％。通过对核心基因m6A突变位点预测找到了可能发生的突变位点，发现大部分突变发生在CDS区并且预测到突变位点上结合蛋白功能均丧失。 综上所述，奶山羊乳腺组织mRNA转录组中，m6A修饰基因的比例、位置和motif等与同一物种中模式一致;在乳腺组织中，m6A的修饰水平与基因表达量之间呈高度负相关;两时期持续被m6A修饰的基因主要涉及到对乳腺上皮细胞的增殖和分化以及乳腺组织发育的调控，少部分调控机体免疫及代谢;通过筛选得到的泌乳、免疫及代谢密切相关的基因中，发现HARS、JUN和EGFR最有可能在调节乳腺发育和泌乳方面发挥关键作用，RIPK1、BIRC2和BIRC5最有可能在免疫调节方面发挥作用，PLCG1、PLCE1和PLCB3最有可能在调节代谢方面发挥作用。
NETL