摘要
近些年来，随着生活质量的不断提升，肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC的发病率和死亡率逐渐升高，极大影响人们的生活。在晚期HCC患者的一线治疗中,多靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKI）索拉非尼是第一个被美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration,FDA）批准用于治疗晚期HCC的一线药物。然而，在临床实践中索拉非尼的耐药问题也日渐凸显，严重影响晚期HCC患者的生存获益。目前，索拉非尼耐药的具体分子机制仍不明确，一般认为，肿瘤细胞、肿瘤微环境和个体遗传都参与其中。索拉非尼耐药的深入研究不仅有助于阐明索拉非尼耐药具体的分子机制,还能筛选出可用于临床监测的生物标志物，有助于预后评估和制定有效的治疗策略。为了进一步探究索拉非尼耐药的机制，进行了相关研究并取得了如下成果: 1.筛选验证HCC索拉非尼耐药与表观遗传修饰相关的关键转录因子 首先，采用低浓度递增联合大剂量间断冲击法构建索拉非尼耐药细胞株，并对其索拉非尼药物敏感性，耐药基因及干性相关基因的表达水平等方面进行鉴定。结合RNA-seq以及ChIP-seq高通量测序技术，绘制HCC索拉非尼耐药细胞表观遗传修饰和转录组图谱。整合分析HCC索拉非尼耐药的表观遗传修饰和转录组数据，针对ChIP-seq中索拉非尼耐药细胞H3K27ac信号显著增强的peaks进行motif分析，结合RNA-seq数据，筛选出耐药细胞中启动子和增强子H3K27ac信号显著增强且同时满足在耐药细胞株中RNA水平上调的转录因子。通过公共数据库进一步筛选得到转录因子FOXA1。qRT-PCR和Westernblot分别验证FOXA1在索拉非尼敏感和耐药细胞中mRNA和蛋白水平表达。结果显示，FOXA1在索拉非尼耐药细胞中的表达水平显著上调。 2.体外实验明确FOXA1在HCC发生发展中的作用 在上述研究中，初步鉴定出FOXA1与HCC索拉非尼耐药具有显著相关性，但是FOXA1在肿瘤中的作用，特别是在HCC发生发展中的功能尚不明确。为了揭示FOXA1的功能，本部分在上述实验的基础上构建FOXA1敲低的耐药细胞系。采用CCK8实验检测稳定敲低FOXA1的耐药细胞系对索拉非尼敏感性的变化。通过细胞划痕、Transwell、Matrigel等实验，研究FOXA1调节HCC细胞侵袭、迁移能力的作用。利用艾森和克隆形成实验探究FOXA1对HCC细胞增殖能力的影响。结果显示，敲低FOXA1后，耐药细胞对索拉非尼的敏感性显著上升，其增殖、迁移和侵袭能力显著下降。证明FOXA1在调控HCC发生、发展以及耐药中发挥重要作用。 3.公共数据库挖掘FOXA1在HCC组织中的临床意义 为了探索FOXA1在HCC组织中的临床意义，利用TCGA、UALCAN以及GEO数据库分析发现FOXA1在HCC肿瘤组织中的表达上调;利用TCGA数据生存分析验证FOXA1表达水平与HCC患者预后的相关性以及FOXA1在TME中的作用。与低表达患者相比，FOXA1高表达的患者生存更差。TME的特征也存在显著差异，FOXA1高表达亚型以显著的免疫抑制为特征。最后建立基于FOXA1表达与肿瘤分期的预后模型，并通过ICGC和GEO数据库对模型进行了验证，该模型具有一定的预测能力。 综上所述，本研究通过ChIP-seq等测序技术发现了转录因子FOXA1在索拉非尼耐药细胞中表达升高，且FOXA1参与调控索拉非尼耐药及HCC转移。此外，FOXA1在临床HCC组织中的表达也显著上调，FOXA1高表达的患者生存更差，并以显著的免疫抑制为特征。以FOXA1表达为基础建立的临床预后模型也有一定的预测价值。本研究不仅有助于揭示FOXA1在HCC发生发展及索拉非尼耐药中的分子调控机制，而且为索拉非尼的精准靶向用药提供有效的新型分子标志物。
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