摘要
背景和目的 口腔癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，鳞状细胞癌(squamouscellcarcinoma,SCC)是最常见的口腔癌组织学类型，在口腔癌组织分类中约90％的病例被归类为口腔鳞状细胞癌(oralsquamouscellcarcinoma,OSCC),吸烟和饮酒是其主要危险致病因素，在世界范围内口腔鳞状细胞癌的患病率呈整体上升趋势，其患病群体趋于年轻化。在疾病的早期诊断相对容易，但不幸的是,大多数患者在诊断时已处于中期或者晚期。手术是治疗的首选方案，虽然手术治疗能够控制肿瘤的发展，但口腔颌面部血运丰富，解剖结构复杂，约1/3的患者接受常规的手术或放疗后仍会出现复发和远处转移而需要再治疗。中晚期患者一旦口腔鳞状细胞癌扩散转移，或侵袭重要解剖部位时便已失去手术治疗机会，姑息治疗就成为常见的治疗方案，但放疗影响大，化疗易耐药，预后较差，死亡率高达50％。因此，迫切需要我们进一步深入研究探讨口腔鳞状细胞癌的侵袭和转移的具体机制，这将对应对口腔鳞状细胞癌侵袭和迁移具有十分重要的意义。 肿瘤微环境(tumormicroenvironment,TME)在癌细胞的启动、进展和转移方面发挥着重要作用，最新的研究表明，调节肿瘤微环境的生化成分可能成为治疗肿瘤的一种新策略。分析肿瘤微环境中的生化组成成分时发现三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)是肿瘤微环境的主要生化成分之一，研究发现,在某些肿瘤中，ATP具有明显的促进肿瘤增殖、侵袭和迁移的作用。ATP作为一种重要肿瘤细胞外信号分子逐渐成为研究的热点。目前对ATP在肿瘤方面的研究主要集中在列腺癌、乳腺癌、直肠癌、膀胱癌等少数肿瘤，ATP作为信号分子是否具有普遍性需要进一步研究，ATP在OSCC中所发挥的细胞外分子的调控作用目前研究尚不明确。因此，本研究旨在探究ATP作为细胞外信号分子对OSCC细胞生物学行为的调控作用，并阐明其可能的作用机制，以期为OSCC肿瘤治疗提供新思路。 材料与方法 第一部分:评价ATP对OSCC细胞生物学行为的影响 复苏CAL27和SCC15细胞系，以0、50μM、100μM、200μM浓度的ATP处理CAL27和SCC15细胞，CCK8实验、划痕实验、Transwell实验和克隆形成实验，检测外源性ATP对OSCC细胞的增殖、侵袭和迁移的生物学行为的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中相关侵袭和迁移转录因子Snail、MMP2、MMP9、E-cadherin和Vimentin的表达。 第二部分:阐明ATP促进OSCC细胞侵袭和迁移与P2Y2-Src-EGFR轴的关系2.1OSCC癌组织中P2Y2、Src和EGFR的表达情况 从UACAN中下载TCGA-HNSC数据库，筛选出520个OSCC样本和44个对照样本进行生物信息学分析，阐明P2Y2、Src和EGFR在OSCC组织和对照样本中的表达差异;从TIMER数据库分析P2Y2与Src和EGFR的相关性;从STRING数据库对P2Y2进行蛋白相互作用分析;Westernblot和qRT-PCR实验方法检测OSCC组织中P2Y2、Src和EGFR的表达差异。 2.2OSCC细胞中P2Y2、Src、EGFR的表达情况 采用Westernblot和qRT-PCR检测ATP处理的OSCC细胞中P2Y2、Src和EGFR的表达差异。 第三部分:探究ATP通过P2Y2-Src-EGFR轴调控OSCC细胞侵袭和迁移的分子机制 3.1P2Y2参与ATP对OSCC细胞侵袭和迁移的调控作用 使用siRNA敲低OSCC细胞中P2Y2的表达，采用Westernblot和qRT-PCR检测转染效率，并筛选最优siRNA序列;使用划痕实验、Transwell实验和克隆形成实验检测P2Y2敲低对OSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响;体内裸鼠成瘤实验检验P2Y2敲低对OSCC移植肿瘤生长情况的影响;qRT-PCR检测P2Y2敲低对OSCC细胞袭和迁移相关因子基因Snail、MMP2、MMP9、E-cadherin和Vimentin的表达变化。 3.2ATP通过P2Y2-Src-EGFR轴促进OSCC细胞的侵袭和迁移 Westernblot检测P2Y2敲低对ATP诱导的OSCC细胞Src和EGFR的表达影响;Westernblot检测Src抑制剂(Dasatinib)对ATP诱导的OSCC细胞EGFR表达的影响。 3.3PI3K/AKT信号通路参与外源性ATP调控OSCC细胞的侵袭和迁移 利用TCGA数据库中口腔鳞状细胞癌的转录组数据，通过GSEA富集分析，探索P2Y2与PI3K/AKT信号通路的相关性;Westernblot方法检测外源性ATP刺激OSCC细胞后PI3K和AKT表达影响;采用Westernblot检测P2Y2敲低,对OSCC细胞中PI3K和AKT表达影响;采用Westernblot检测分析抑制Src和EGFR表达后，ATP诱导OSCC细胞PI3K和AKT的表达情况;克隆形成实验、Transwell实验和划痕实验阐明PI3K和AKT抑制后ATP对OSCC细胞侵袭和迁移的影响。 研究结果 第一部分:ATP促进OSCC细胞增殖、侵袭和迁移 CCK8实验结果表明，当ATP浓度为100μM时OSCC细胞活力最强，选择100μM浓度的ATP作为后续实验的浓度;细胞划痕实验、Transwell实验和克隆形成实验分析显示外源性ATP促进OSCC细胞的侵袭和迁移;qRT-PCR检测发现OSCC细胞中侵袭和迁移相关因子基因Snail,MMP2、Vimentin和MMP9表达增加，E-cadherin表达降低。 第二部分:ATP促进OSCC细胞侵袭和迁移与P2Y2-Src-EGFR轴密切相关2.1OSCC癌组织中P2Y2、Src和EGFR的表达情况 生物信息学结果显示:与癌旁的正常组织相比,Src和EGFR高表达于OSCC组织，且P2Y2的表达与Src和EGFR的表达高度相关;蛋白互作分析显示P2Y2、Src和EGFR蛋白之间也存在互作关系;Westernblot和qRT-PCR实验结果表明:与癌旁的健康组织相比，P2Y2、Src和EGFR高表达于OSCC组织。 2.2OSCC细胞中P2Y2、Src、EGFR的表达情况 Westernblot和qRT-PCR实验结果表明;与正常口腔黏膜细胞相比，P2Y2、Src和EGFR在ATP处理OSCC细胞中高表达;P2Y2、Src和EGFR的升高具有剂量(0、50μM、100μM、200μMATP)依赖性和时间(0、2min、5min、10min、20min、30min)依赖性。 第三部分:ATP通过P2Y2-Src-EGFR轴激活PI3K/AKT通路，促进OSCC细胞的侵袭和迁移 3.1P2Y2参与ATP对OSCC细胞侵袭和迁移的调控作用 体外划痕实验、Transwell实验和克隆形成实验分析显示P2Y2敲低显著抑制OSCC细胞的增殖、侵袭和迁移;裸鼠成瘤实验结果显示P2Y2敲低可以显著抑制OSCC移植肿瘤的生长;qRT-PCR结果显示:P2Y2敲低导致OSCC细胞中侵袭和迁移相关因子基因Snail、MMP2、MMP9和Vimentin表达受到抑制，E-cadherin表达增强。 3.2ATP通过P2Y2-Src-EGFR轴促进OSCC细胞的侵袭和迁移 Westernblot结果显示:与对照组相比P2Y2,敲低可减弱ATP诱导的OSCC细胞Src和EGFR的表达;Westernblot结果显示:与正常对照组相比，Src抑制剂(Dasatinib)显著降低EGFR的表达。 3.3PI3K/AKT信号通路参与外源性ATP调控OSCC细胞的侵袭和迁移 生物信息学结果显示:PI3K/AKT通路在高表达P2Y2的口腔鳞状细胞癌中被显著激活;Westernblot结果显示:ATP刺激OSCC细胞后会导致p-PI3K和p-AKT表达升高;而P2Y2敲低导致p-PI3K和p-AKT的表达显著减少;抑制Src和EGFR表达导致p-PI3K和p-AKT的表达显著降低;克隆形成实验、Transwell实验和划痕实验显示，使用PI3K和AKT抑制剂会显著抑制ATP对OSCC细胞增殖、侵袭和迁移。 结论 1.外源性ATP激活P2Y2促进OSCC细胞增殖、侵袭和迁移。 2.Src和EGFR的mRNA及蛋白在OSCC组织和细胞中均高表达，P2Y2-Src-EGFR轴激活PI3K/AKT通路促进OSCC细胞的侵袭和迁移。 3.外源性ATP作为肿瘤微环境中的一种重要细胞外信号分子，在肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移过程中具有重要的作用。本研究表明，ATP通过P2Y2-Src-EGFR轴激活PI3K/AKT信号通路促进OSCC细胞的侵袭和迁移。
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