摘要
植物茎尖分生组织经分裂、分化产生地上部分所有组织和器官，从而决定植物地上部分的形态建成。拟南芥转录因子WUSCHEL(WUS)在茎尖分生组织维持过程中发挥关键作用。WUS基因突变导致茎尖分生组织无法维持，其突变体茎尖分生组织产生数量有限的器官后终止发育。WUS蛋白在茎尖分生组织的组织中心(organizingcenter,OC)表达，通过胞间连丝向周围细胞移动，并以低浓度形式存在于CLAVATA3(CLV3)表征的干细胞区。低浓度的WUS促进CLV3表达，从而赋予中央区细胞干细胞特征。然而，干细胞区WUS蛋白以低浓度形式存在的分子机制尚不清楚。本研究发现，26S蛋白酶体亚基RegulatoryParticleTriple-AATPase2a(RPT2a)与WUS蛋白存在直接相互作用，并在干细胞区介导WUS通过26S蛋白酶体途径降解，维持WUS蛋白的低浓度，从而激活CLV3基因表达，调控茎尖分生组织干细胞稳态。主要研究结果如下: (1)RPT2a调控拟南芥茎尖分生组织发育。 为了解析干细胞区WUS蛋白以低浓度形式存在的分子机制，本研究通过免疫共沉淀(Co-IP)与液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术筛选WUS互作蛋白，鉴定到26S蛋白酶体亚基RPT2a。与野生型相比，RPT2a基因功能缺失导致茎尖分生组织明显减小，分化侧生器官的数目减少等茎尖分生组织发育异常的表型。pRPT2a∷RPT2a-GFP载体转化rpt2a-2突变体后可以完全回补突变体茎尖分生组织发育异常的表型。通过原位杂交及荧光观察发现，RPT2a在拟南芥茎尖分生组织细胞中表达。表明RPT2a调控拟南芥茎尖分生组织发育。 (2)RPT2a与WUS存在直接相互作用。 为了验证RPT2a与WUS存在直接相互作用，通过酵母双杂交和Pull-down实验证明RPT2a与WUS在植物体外存在直接相互作用;Co-IP和BiFC实验证明RPT2a与WUS在植物体内存在相互作用。 (3)RPT2a介导WUS蛋白通过26S蛋白酶体途径降解。 为了探究RPT2a是否调节茎尖分生组织特征基因WUS和CLV3的表达，进而调控茎尖分生组织发育。本研究通过RT-PCR检测了野生型和rpt2a-2突变体中WUS、CLV3的表达量，发现在rpt2a-2突变体中CLV3的表达量显著低于野生型;而WUS的表达量与野生型没有明显差异。进而，在野生型和rpt2a-2突变体中分别观察了pCLV3∷GFP和PWUS∷WUS-3GFP的表达模式，发现rpt2a-2突变体中CLV3的表达相比野生型明显减弱，而rpt2a-2突变体中WUS蛋白表达相比野生型明显增强。说明RPT2a可能介导WUS蛋白降解，并调控CLV3基因表达。 RPT2a作为26S蛋白酶体的组成亚基，在26S蛋白酶体活性维持过程中发挥重要作用。本研究推测RPT2a可能介导WUS蛋白通过26S蛋白酶体途径降解。Cell-free蛋白降解实验发现，随着处理时间的延长，野生型体系中WUS蛋白逐渐降解，蛋白酶体抑制剂MG132可以显著抑制WUS蛋白降解，表明WUS蛋白可以通过26S蛋白酶体途径降解;与野生型相比，rpt2-2突变体中WUS蛋白降解速率显著下降，表明RPT2a可以调控WUS蛋白稳定性。这些结果表明，RPT2a可以介导WUS蛋白通过26S蛋白酶体途径降解。 (4)RPT2a在干细胞区介导WUS蛋白降解。 为了探究RPT2a介导WUS蛋白降解是否特异发生在干细胞区，分析了RPT2a在拟南芥茎尖分生组织不同细胞层的表达模式，发现RPT2a主要在茎尖分生组织中央区和外周区表达，而在组织中心基本不表达，表明RPT2a可能在茎尖分生组织特定区域介导WUS蛋白降解。进而，在rpt2a-2突变体茎尖分生组织不同区域特异表达RPT2a,发现在茎尖分生组织干细胞区表达RPT2a能够回补rpt2a-2突变体茎尖分生组织发育异常的表型，而在组织中心和花原基中表达RPT2a不能回补rpt2a-2突变体茎尖分生组织发育异常的表型，表明RPT2a特异在干细胞区介导WUS蛋白降解，进而维持茎尖分生组织正常发育。 (5)在clv3-2突变体背景下突变RPT2a导致WUS蛋白明显积累、茎尖分生组织显著增大，茎尖干细胞区占茎尖分生组织的比例减小。 为了在体内进一步验证RPT2a可以介导WUS蛋白降解，本研究将rpt2a-2突变体与WUS转录水平升高的clv3-2突变体杂交，发现rpt2a-2clv3-2双突变体茎尖分生组织相比clv3-2突变体显著增大，并且茎尖分生组织中WUS蛋白积累量明显升高。通过对茎尖转录组数据与之前报道的WUS蛋白ChIP-seq数据及茎尖不同区域TRAP-seq数据联合分析，发现rpt2a-2clv3-2双突变体中许多茎尖分生组织特征基因和WUS蛋白的潜在靶基因(如LOG4、AIL7等)均上调。以上结果进一步证明RPT2a可以在体内介导WUS蛋白降解。此外，本研究发现，与clv3-2突变体相比，rpt2a-2clv3-2双突变体中细胞周期相关基因表达上调，A类4RR基因表达下调，进而促进茎尖分生组织细胞增殖，导致茎尖分生组织显著增大。但是，rpt2a-2clv3-2双突变体干细胞区占茎尖分生组织的比例相比clv3-2突变体明显减小，而与rpt2a-2突变体无明显差异。综上所述，RPT2a突变导致WUS蛋白显著积累，进而抑制CLV3表达，最终导致茎尖分生组织中干细胞比例减少。 (6)与26S蛋白酶体其他亚基相比，RPT2a特异调控茎尖分生组织稳态。 为了探究26S蛋白酶体其他亚基是否调控植物茎尖分生组织稳态，本研究首先证明，除RPT2a之外，26S蛋白酶体其他亚基RPT2b、RPT4a、RPT6a、RPN8a及PBE1也能与WUS蛋白互作。其次，为了验证这些亚基是否参与茎尖分生组织稳态的维持，分别观察了其功能缺失突变体的表型，发现rpt4a、rpt6a、rpn8a和pbe1突变体茎尖分生组织的表型均与野生型没有明显差异，且rpt4arpt2a-2、rpt6arpt2a-2、rpn8arpt2a-2和pbe1rpt2a-2双突变体并未表现出较rpt2a-2突变体更为严重的茎尖分生组织异常表型，说明除RPT2a之外，其他与WUS互作的26S蛋白酶体亚基并不参与茎尖分生组织发育的调控过程。 综上所述，本研究鉴定到维持茎尖分生组织干细胞区WUS蛋白以低浓度形式存在的关键调控因子——RPT2a。RPT2a在茎尖分生组织中央区和外周区特异表达，并在干细胞区介导WUS蛋白通过26S蛋白酶体途径的降解，进而低浓度的WUS激活CLV3表达，最终维持茎尖分生组织干细胞稳态。本研究揭示了茎尖分生组织干细胞区WUS蛋白以低浓度形式存在的机制，为理解植物茎尖分生组织干细胞稳态的维持提供了新的重要信息。
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