摘要
研究背景 肝硬化是各种急性或慢性肝脏损伤所导致的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)过度沉积的病理学改变，是各种慢性肝病进展的共同结局。食管静脉曲张(esophagealvarices,EV)破裂出血是肝硬化门脉高压患者最严重的并发症之一。尽管采用《BavenoVII门静脉高压共识》推荐的食管静脉曲张套扎术联合非选择性P受体阻滞剂作为标准治疗方案，自首次EV出血后恢复的患者2年内EV再出血率仍可达37-50％。因此，对经过标准治疗后EV再出血的预测和对EV再出血高风险患者的识别，对改善肝硬化患者预后具有重大意义。众所周知，内镜检查和肝静脉压力梯度测定是评估EV再出血的重要手段，但两种检查花费高、有侵入性，不能作为EV再出血的常规检查手段。此外，传统影像学检查预测EV再出血的准确性和临床适用性也存在一定的局限性。因此，寻找一种准确、有效的无创预测方法，有助于EV再出血的干预和管理。影像组学通过对医学影像信息进行挖掘，可以高通量地提取并筛选出最有价值的影像组学特征,为疾病的诊疗提供帮助。近年来，影像组学在肝硬化和门静脉高压的诊断以及食管胃底静脉曲张破裂出血风险评估等诸多领域均有应用。然而，影像组学能否准确预测EV治疗后再出血仍然值得研究。 肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是肝硬化常见并发症之一，手术切除是HCC的一线治疗方式。大多数肝硬化肝癌患者存在肝功能受损情况，较易发生肝切除术后肝衰竭(post-hepatectomyliverfailure,PHLF)。因此，术前肝功能评估和PHLF风险评估对于预测肝硬化HCC患者的预后至关重要。目前，几种方法已被报道用于评估术前肝功能，如Child-Pugh评分、吲哚菁绿试验等，但上述预测手段准确性不高，未能在临床上普及。钆贝葡胺(Gadobenatedimegramine,Gd-BOPTA)是一种肝胆特异性磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)造影剂，不仅可以用于肝脏病灶形态学检测，还可用于肝功能评估。我们课题组前期研究表明，肝胆期特异性造影剂的肝实质和胆道成像对肝硬化患者临床结局的预测具有重要价值。然而，使用肝胆特异性造影剂的胆道成像预测肝硬化HCC患者PHLF的临床可行性有待进一步研究。 虽然针对肝硬化及其并发症预后的预测有助于患者进行早期干预、治疗，但对于肝硬化患者而言，通过相应治疗在一定程度上抑制肝硬化进展，改善肝功能与肝脏结构，对预防并发症的发生、发展同样具有重要意义。尽管多种药物被报道可以治疗肝硬化，但目前仍然缺乏一种公认有效的肝硬化治疗药物。肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)活化是肝硬化发生发展的主要环节，而衰老的肝细胞也可以诱导HSC的激活，从而促进肝硬化的发展，对于HSC活化和肝细胞衰老的抑制均可以显著抑制肝硬化的进展。因此，我们利用可装载药物、清除活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)以及MRI成像的多功能纳米材料Fe3O4-MnO2(简称Fe-Mn),将胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor1,IGF-1)和CXC趋化因子受体4(CXC-chemokinereceptor,CXCR4)拮抗剂AMD3100负载其中，构建了一种多功能纳米载药颗粒Fe-Mn-IGF-AMD,以期通过对肝脏靶向递送IGF-1与AMD3100、改善肝脏微环境等策略达到抑制肝硬化的目的。 本研究分为三个部分。在第一部分，我们利用173例肝硬化患者的肝脏和脾脏的CT影像组学特征通过建立“肝-脾”联合模型，开发出了一个预测EV治疗后再出血的影像组学模型并验证了其预测EV再出血的效能。同时，我们利用建立的模型对患者进行EV再出血的危险分层，使得EV再出血的人群管理更加精准。在第二部分，我们探讨了Gd-BOPTA胆道成像指标胆道相对增强率(therelativeenhancementratioofthebiliarysystem,REB)对肝硬化HCC患者切除术前肝功能的预测效能。进一步研究发现，REB可以准确地预测肝硬化HCC患者PHLF的发生，REB≤2.21的患者相较于REB＞2.21的患者显示出更高的PHLF发生率。在第三部分我们利用具有核壳中空结构的Fe3O4-MnO2纳米颗粒(nanoparticle,NP)将IGF-1和AMD3100两种药物包裹在内组成了一个基于多功能纳米材料的载药颗粒Fe-Mn-IGF-AMD。我们证实了Fe-Mn-IGF-AMD具有良好的肝硬化治疗效果。随后，我们验证了Fe-Mn-IGF-AMD可通过抑制HSC激活、减轻肝细胞衰老和有效清除ROS并改善肝脏缺氧等机制来发挥抗肝硬化作用。此外，Fe-Mn-IGF-AMD在MRIT1和T2的成像可作为诊断肝硬化的有效手段。 综上，本研究提供了无创、准确的基于影像学的肝硬化并发症(EV再出血和肝硬化HCC患者PHLF)预后预测新模型;同时构建了具有肝硬化抑制作用并可通过MRI诊断肝硬化的多功能纳米载药颗粒Fe-Mn-IGF-AMD,为实现肝硬化的诊疗一体化提供了新的思路和可行方案。 第一部分基于CT的影像组学评分预测肝硬化患者食管静脉曲张再出血风险的研究 目的 EV再出血是肝硬化最严重的并发症之一，对于EV再出血的预测有助于改善患者预后，减少不必要的内镜检查。本研究旨在从肝硬化患者的肝脏和脾脏计算机断层扫描(computedtomography,CT)图像中提取影像组学特征并构建影像组学评分(Rad评分)，以预测EV再出血风险。 方法 1.本研究纳入了173例自首次EV出血后恢复并经过标准方案治疗后的肝硬化患者，收集患者入院检查资料及术前腹部强化CT数据。 2.在肝脏和脾脏CT图像中提取影像组学特征，采用最小绝对收缩和选择算子(leastabsoluteshrinkageandselectionoperator,LASSO)-Cox回归用于特征的筛选并分别生成基于肝脏、脾脏和肝-脾联合的影像组学评分(Rad-scoreLiver、Rad-scoreSpleen和Rad-scoreLiver-Spleen)。 3.通过一致性指数(concordanceindex,C-index)、校准曲线和决策曲线分析(decisioncurveanalysis,DCA)评估Rad评分预测肝硬化EV再出血的准确性和临床获益。Kaplan-Meier生存分析用于评估Rad评分的危险分层能力。 结果 1.Rad-scoreLiver、Rad-scorespleen和Rad-scoreLiver-Spleen三种影像组学评分均为肝硬化EV再出血的独立危险因素。 2.Rad-scoreLiver-Spleen展现出了良好的EV再出血预测能力，训练队列和验证队列的C-index分别为0.853[95％可信区间(confidenceinterval,CI),0.776-0.904]和0.822(95％CI,0.749-0.875)。 3.校准曲线结果表明，Rad-scoreLiver-Spleen预测的EV再出血概率与实际概率非常接近，具有较高的预测准确性。DCA结果显示，Rad-scoreLiver-Spleen相较于Rad-scoreLiver和Rad-scorespleen产生了更多的临床获益，表明Rad-scoreLiver-Spleen比Rad-scoreLiver和Rad-scorespleen在预测肝硬化患者EV再出血方面更实用。在训练和验证队列中，Rad-scoreLiver-Spleen都可以精确地将患者分低、中、高三个EV再出血风险组，且三组间的EV再出血率具有统计学差异。 4.亚组分析显示乙型肝炎病毒队列中Rad-scoreLiver-Spleen的C-index高于非HBV队列。 结论 利用肝硬化患者的肝脏和脾脏CT图像信息构建的影像组学评分Rad-SCoreLiver-Spleen可以准确地预测EV治疗后再出血风险并将患者根据EV再出血风险进行危险分层，该评分为EV再出血的无创评估提供了新的预测工具。 第二部分钆贝葡胺增强的磁共振胆道成像预测肝硬化肝癌患者术后肝衰竭的研究 目的 PHLF是肝切除术后最致命的并发症之一，对PHLF的准确预测有利于改善肝硬化肝癌患者的预后。本研究旨在探究Gd-BOPTA增强的肝胆期胆道成像在预测肝硬化HCC患者PHLF发生风险中的价值。 方法 1.本研究在两个医疗中心纳入了221例肝切除术前接受Gd-BOPTA增强MRI扫描的肝硬化HCC患者，并收集了患者术前MRI图像和入院检查资料。 2.在MRI的肝胆期测量胆道相对增强率(therelativeenhancementratioofthebiliarysystem,REB)与肝脏-肌肉比(thelivertomuscleratio,LMR)并通过工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC)分析REB和LMR预测术前肝功能的效能。 3.通过Logistic回归分析PHLF发生的潜在危险因素。通过ROC分析REB和LMR预测PHLF和术后严重并发症(majorcomplicaiotions)的效能。 结果 1.REB区分Child-PughA和Child-PughB级患者的效能显著高于LMR,说明REB预测术前肝功能的效能高于LMR。 2.REB是PHLF的独立危险因素(比值比[oddsratio,OR]=0.127[0.047-0.348],p＜0.001)。尽管LMR倾向于与PHLF相关(p=0.063),但在多变量分析中,LMR不是PHLF的独立危险因素(OR=0.624[0.023-16.709],p=0.079)。 3.REB和LMR预测PHLF的受试者工作特征曲线下面积(areaunderthecurveofthereceiveroperatingcharacteristiccurve,AUC)分别为0.87和0.60。REB的最佳截断值为2.21。REB≤2.21的HCC患者PHLF的发生率显著高于REB＞2.21的患者(60.0％对8.5％,p＜0.001)。 4.REB和LMR预测术后严重并发症的AUC分别为0.80和0.59。 结论 Gd-BOPTA增强的肝胆期胆道成像可以准确地预测肝硬化HCC患者切除术后的PHLF和严重并发症的发生，为肝硬化HCC患者术后的预后提供了可靠的预测手段。 第三部分基于多功能纳米材料的载药颗粒对肝硬化治疗效果的研究 目的 肝硬化是一个复杂的病理生理过程，HSC的活化、肝细胞的衰老、ROS的积聚和肝内缺氧等机制均可促进肝硬化的进展。尽管多种药物被报道可以治疗肝硬化，但目前仍然缺乏一种公认有效的肝硬化治疗药物。本研究旨在利用基于Fe3O4-MnC2核壳中空结构的多功能纳米材料Fe-Mn与具有抗肝硬化效果的IGF-1、AMD3100组成一种新型多功能纳米载药颗粒Fe-Mn-IGF-AMD,并验证其抗肝硬化效果和治疗机制。 方法 1.通过扫描电子显微镜、X线衍射图谱、傅里叶变换红外光谱和振动样品磁强计等方法对Fe3O4相关纳米颗粒(Nanoparticles,NPs)进行检测和表征。 2.为检测Fe-Mn-IGF-AMD对细胞是否具有毒性，采用CCK-8法检测不同铁浓度的Fe-Mn、Fe-Mn-IGF、Fe-Mn-AMD和Fe-Mn-IGF-AMD对LX-2、HepG2和RAW264.7生存率的影响。采用HE染色评估Fe-Mn、Fe-Mn-IGF、Fe-Mn-AMD和Fe-Mn-IGF-AMD对心、脾、肺和肾组织结构的影响。 3.为评估Fe-Mn-IGF-AMD治疗肝硬化的效果，采用天狼猩红染色、马松染色和肝脏羟脯氨酸含量测定，检测各组小鼠肝组织中胶原成分的含量。检测血清AST和ALT含量以评估肝功能损伤情况。 4.为评估Fe-Mn-IGF-AMD对HSC活化的作用,采用普鲁士蓝染色探究Fe-Mn、Fe-Mn-IGF、Fe-Mn-AMD和Fe-Mn-IGF-AMD在肝硬化小鼠肝脏中的分布和TGF-β1激活的LX-2对NPs的吸收程度。运用免疫组化和Westernblot技术检测正常小鼠、肝硬化小鼠和各治疗组中肝脏α-平滑肌动蛋白(α-smoothactin,α-SMA)的表达水平，采用免疫荧光技术检测正常小鼠、肝硬化小鼠和各治疗组中肝脏CXCR4的表达。采用免疫荧光技术检测正常小鼠、肝硬化小鼠和各治疗组中肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)在肝脏的含量以及HGF与α-SMA的共定位情况。 5.为检测Fe-Mn-IGF-AMD对肝硬化肝脏衰老的作用，采用衰老相关β-半乳糖苷酶(senesce-associatedβ-galactosidase,SA-P-gal)染色检测正常小鼠、肝硬化小鼠和各治疗组中肝组织衰老细胞的比例。根据免疫荧光双染检测各组小鼠肝组织中衰老标志物p53和肝细胞标志物白蛋白Albumin、巨噬细胞标志物F4/80和HSC标志物α-SMA的共定位情况分析确定Fe-Mn-IGF-AMD对何种细胞的衰老产生作用。采用Westernblot检测H2O2作用的HepG2在各治疗组中衰老标志物p21、p16的蛋白表达水平，采用qRT-PCR检测H2O2作用的HepG2在各治疗组中衰老相关分泌表型IL-1β、IL-6和MMP-9的表达。 6.为检测Fe-Mn-IGF-AMD对肝硬化ROS和缺氧状态的影响，采用免疫荧光技术检测正常组、肝硬化组和各治疗组中小鼠肝脏中ROS含量和缺氧标志物pimonidazole的表达水平;使用免疫组化检测正常组、肝硬化组和各治疗组中小鼠肝脏中4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)表达情况;使用细胞免疫荧光检测各治疗组对细胞内ROS的清除能力。 7.为检测Fe-Mn-IGF-AMD是否可以作为诊断肝硬化的有效手段之一，使用MRI检测Fe-Mn的弛豫率，并将Fe-Mn、Fe-Mn-IGF、Fe-Mn-AMD和Fe-Mn-IGF-AMD注入正常小鼠和肝硬化小鼠体内12h后在T1与T2成像中检测两组小鼠体内信号值是否具有差异。 结果 1.合成的NPs具有良好的稳定性、结晶度、致密性和超顺磁性。 2.Fe浓度为1、2、5和10μg/mL的Fe-Mn、Fe-Mn-IGF、Fe-Mn-AMD和Fe-Mn-IGF-AMD对HepG2和RAW264.7无明显毒性;Fe浓度为2μg/mLFe-Mn-IGF-AMD对LX-2、HepG2和RAW264.7细胞的凋亡率无显著影响。Fe-Mn、Fe-Mn-IGF、Fe-Mn-AMD和Fe-Mn-IGF-AMD对心、脾、肺和肾组织结构无显著影响。 3.Fe-Mn-IGF-AMD组小鼠肝脏的天狼猩红染色阳性面积、马松染色阳性面积、羟脯氨酸含量及血液中AST和ALT的含量均显著低于其他NPs组和未治疗组。 4.普鲁士蓝染色结果表明活化的HSC对Fe-Mn-IGF、Fe-Mn-AMD和Fe-Mn-IGF-AMD的吸收增加，且对Fe-Mn-IGF-AMD的吸收率显著高于其他NPs。Fe-Mn-IGF-AMD相较于其他NPs可以更有效地抑制α-SMA和CXCR4的表达。Fe-Mn-IGF-AMD可通过促进HSC分泌HGF显著提高肝硬化组织总中HGF的含量。 5.肝硬化组p53阳性的肝细胞和HSC数量明显多于对照组，所有NPs对p53阳性的HSC和巨噬细胞数量均无影响，其中含IGF-1成分的Fe-Mn-IGF和Fe-Mn-IGF-AMD能显著降低p53阳性的肝细胞数量。此外,Fe-Mn-IGF-AMD对H2O2作用的HepG2细胞中p21和p16蛋白以及衰老相关分泌表型IL-1β、IL-6和MMP-9的mRNA水平相较于Fe-Mn和Fe-Mn-AMD均有明显的抑制作用。 6.与正常肝组织相比，肝硬化组织中的ROS、4-HNE和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量较对照组表达升高，而各NPs治疗组均可显著降低ROS、4-HNE和MDA的产生,与Fe-Mn、Fe-Mn-IGF和Fe-Mn-AMD组相比，Fe-Mn-IGF-AMD组的ROS、4-HNE和MDA含量表达显著降低。与正常肝组织相比，肝硬化组织中缺氧染色面积显著升高，而各NPs治疗组中肝组织的缺氧状态均有不同程度改善。各NPs对H2O2作用的HepG2细胞产生的ROS均展现出了良好的清除能力，其中Fe-Mn-IGF和Fe-Mn-IGF-AMD对ROS的清除能力显著高于其他NPs。 7.相较于注射了Fe-Mn-IGF-AMD的正常组小鼠，注射Fe-Mn-IGF-AMD的肝硬化小鼠肝脏T1相对信号强度显著升高，T2相对信号强度显著下降。其余小鼠注射Fe-Mn、Fe-Mn-IGF和Fe-Mn-AMD后的正常组和肝硬化的相对信号强度未见显著性差异。 结论: 基于多功能纳米材料的载药颗粒Fe-Mn-IGF-AMD通过对HSC活化的抑制、抗肝细胞衰老、清除肝脏微环境ROS和改善肝组织缺氧等作用达到了抑制肝硬化的目的。同时，该NP在MRIT1和T2的成像可作为诊断肝硬化的有效手段,这对于实现肝硬化的诊疗一体化提供了新策略，具有重要临床意义。
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