摘要
中国是世界上最大的奶类进口国，预计到2028年鲜奶进口量将达90多万吨。然而乳蛋白提取成本高、受饲料资源短缺等问题影响大。乳铁蛋白(LF)是一种铁结核性糖蛋白，它具有铁结合/转移，抗菌，抗病毒，抗真菌，抗炎和抗癌特性。α-乳白蛋白(α-LA)富含了人体所需要的必需氨基酸，易被消化吸收，在营养学中被称作为“蛋白之王”。有助于缓解压力，改善睡眠。毕赤酵母表达系统属于真核表达系统，并且技术越来越成熟。 本研究主要是毕赤酵母高效结合外源糖蛋白乳铁蛋白和α-乳白蛋白。LF工程菌(GS115-pPICZαA-LF)在30℃、200rpm、0.5％甲醇诱导诱导发酵24小时至48小时后，LF在毕赤酵母GS115中获得分泌表达，培养基装液量不能超过摇瓶的1/4,诱导蛋白表达期间的温度也控制在30℃以内有利于蛋白的表达。经摇瓶发酵1L发酵液中获得LF粗品480mg。高密度发酵300mL发酵液经硫酸铵沉淀可获得190mg的粗蛋白，是摇瓶水平的1.3倍。LF的等电点为8.5左右，在pH为6.8的缓冲液中目的蛋白相较稳定，利用pH梯度洗脱目的蛋白，在pH为7.4的洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来。并且乳铁蛋白可以螯合铁离子，是一种可以充分发挥补铁作用的蛋白，实验设计胞内残留的乳铁蛋白螯合铁离子的能力是否有增加，本实验利用邻二氮菲比色法测定酵母蛋白的含铁量，实验结果为2.5g重组毕赤酵母GS115-pPICZαA-LF细胞螯合铁离子为61.833μg,LF工程菌胞内残留乳铁蛋白螯合铁离子是出发菌株的2.2倍，表明未来可将其用作富铁酵母。对于标品的检测，将99％纯度的乳铁蛋白样品进行12％SDS-PAGE检测，FN2为牛乳铁蛋白，单体分子量大小为78kDa,含量为89.62％。商品乳清蛋白经15％SDS-PAGE电泳分析，F7为α-牛乳白蛋白，单体分子量为14kDa,蛋白覆盖率达到60％。 α-乳白蛋白工程菌(GS115-pPICZαA-α-LA)在摇瓶条件为26℃,240rpm,0.5％甲醇诱导120h,利用SDS-PAGE检测到在14kDa处检测到目的条带，通过质谱鉴定表明α-乳白蛋白在毕赤酵母GS115中成功获得表达。
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