摘要
目的：针对转移性肺癌化疗和免疫疗法存在的药物靶向性差、免疫反应难控制等问题，制备癌细胞膜包裹的载紫杉醇脂质体菌影制剂，通过肿瘤靶向、免疫刺激、药物治疗协调效应获得高效安全的治疗转移性肺癌效果。 方法：通过薄膜分散法制备紫杉醇脂质体（Liposomalpaclitaxel，LP）；基因工程方法制备菌影（Bacterialghosts，BGs）。将紫杉醇脂质体以电致孔的形式导入菌影内部，制备装载紫杉醇脂质体菌影制剂（LP-loadedBGs，LP@BG），并对电致孔电压条件进行了单因素考察，优化装载处方。体外培养4T1小鼠乳腺癌细胞，通过差速离心法提取纯化的癌细胞膜（Cancercellmembrane，CCM），并通过将癌细胞膜与装载紫杉醇脂质体菌影制剂混合均匀后过聚碳酸酯多孔膜（1μm）反复挤出15次，制备癌细胞膜包裹的载紫杉醇脂质体菌影制剂（CCM-coatedLP@BG，LP@BG@CCM）。采用粒径、电位、扫描电镜、透射电镜及WesternBlot实验对制剂进行相关评价。通过体外细胞实验对制剂抗肿瘤效果及靶向性进行评价；体内抗肿瘤实验评价制剂药效。 经尾静脉注射4T1癌细胞建立转移性肺癌小鼠模型，尾静脉给予各制剂组进行治疗。对肺部肿瘤外观，肿瘤重量、肿瘤组织病理切片、肿瘤细胞凋亡进行考察。通过小动物活体成像观察癌细胞膜及脂质膜包被的载药菌影制剂在体内的分布，评价癌细胞膜的体内靶向效应，以及通过流式细胞仪检测经治疗的各组小鼠脾脏细胞CD4+T细胞、CD8a+T细胞的相对百分比，评价LP@BG@CCM等制剂对免疫细胞的刺激作用。 结果：按大豆磷脂:胆固醇=10:1（w/w）的比例，成功制备粒径较小且均一的紫杉醇脂质体。扫描电镜下BGs的两端或中间位置形成明显孔洞；透射电镜显示其内腔呈现透明状，基本无内容物，细菌内容物基本流出。透射及共聚焦结果表明，电致孔条件为：电压1000V，电击次数为10，能达到最佳的药物加载效果。荧光显微镜结果显示癌细胞膜纯化成功，透射电镜下，癌细胞膜呈现完整的纳米级囊泡结构；癌细胞膜包裹的载紫杉醇脂质体菌影周围有一层透明的细胞膜层，细菌内腔填充内容物，借助共聚焦荧光显微镜进一步观察到，经DiI（1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI）染色的细胞膜（红色）成功包裹在加载香豆素脂质体菌影周围。 体外细胞毒性结果显示，LP@BG@CCM表现出最强的抗4T1肿瘤细胞增殖效果；通过香豆素-6（Coumarin-6，C6）标记的各制剂摄取结果表明，LP组4T1的细胞摄取最弱，LP@BG有一定的黏附靶向细胞作用，但经过CCM包裹后进入4T1细胞核内的量明显增多。 体内小动物活体成像结果显示LP@BG@CCM组小鼠肺部肿瘤荧光最强，解剖小鼠发现其肺部肿瘤区域的荧光强度约为脂质膜包裹载药菌影组的2.5倍。通过肺部外观、病理切片、细胞凋亡检测结果分析，LP@BG、LP@BG@CCM对体内肿瘤有一定的抑制作用，LP@BG@CCM组对肿瘤的抑制作用最强。流式细胞仪检测脾脏中CD4+T细胞和CD8a+T细胞所占百分比结果表明LP@BG?LP@BG@CCM能有效激活免疫细胞，发挥抗肿瘤作用。此外，各制剂组均具有良好的体内外生物安全性。 结论：多功能肿瘤靶向的LP@BG@CCM制剂可通过肿瘤靶向、免疫刺激、药物治疗，协调高效治疗转移性肺癌，是一种具有临床潜在应用价值的抗肿瘤靶向制剂。
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