摘要
背景:阳和汤作为阴疽、流痰的经典方被广泛的运用于骨结核中，大量的文献研究表明阳和汤在治疗脊柱结核上有较好的疗效，但其中作用机制研究尚少。cGAS-STING通路作为天然固有免疫通路与细胞自噬在抗细菌方面作用较为广泛，本课题拟从网络药理学、临床研究、体外细胞实验三个方面，探讨阳和汤通过干预cGAS-STING通路调节巨噬细胞自噬以清除结核分枝杆菌，减弱细胞毒性和炎症反应，增强了自身机体固有免疫和适应性免疫应答水平，为中药治疗脊柱结核提供了一个新的方向。 研究1阳和汤治疗脊柱结核患者疗效的Meta分析 目的:本研究采用系统评价的方法，对阳和汤治疗脊柱结核患者的临床试验进行分析和评价，旨在分析阳和汤治疗脊柱结核的有效性和安全性。 方法:检索中国知网、万方数据库、维普数据库、中国生物医学文献数据库、PubMed,WebofScience,Embase,CochraneCentralRegisterofControlledTrials(CENTRAL)数据库中从建库至今关于阳和汤治疗脊柱结核的文献并进行文献筛选，结合Cochrane系统评价手册中的“偏倚风险”工具评估纳入文献的质量，采用RevMan5.4软件对干预方法的临床疗效、疼痛程度的缓解、肿瘤坏死因子TNF-α的影响、血沉的影响、不良反应进行Meta分析。 结果:本研究纳入的9篇文献评级均为B级，纳入的9项研究中，共549名患者。其中对照组患者共274人，阳和汤治疗的患者共275人。META分析结果:(1)阳和汤治疗组的脊柱患者有效率显著高于对照组患者，差异有统计学意义[OR=6.02,95％CI(2.93,12.38),Z=4.88,P＜0.001]。(2)阳和汤治疗脊柱结核患者可显著减少患者的疼痛强度，差异有统计学意义(MD=-0.72,95％CI(-0.91,-0.53),Z=7.37,P＜0.001)。(3)治疗组辅以阳和汤治疗可显著降低脊柱结核患者TNF-α水平，差异有统计学意义[MD=-1.94,95％CI(-3.06,-0.81),Z=3.38,P＜0.001]。(4)对照组和阳和汤治疗组患者ESR水平无显著差异[MD=-3.05,95％CI(-6.38,0.28),Z=1.79,P=0.07]。(5)治疗组与对照组在治疗过程中产生的不良反应差异无统计学意义[OR=0.68,95％CI(0.37,1.24),Z=1.26,P=0.21]。 小结:阳和汤在治疗脊柱结核疗效上作用较为明显，能够缓解腰背部疼痛、减少肿瘤坏死因子TNF-α水平减轻炎症反应，在改善血沉及减少不良反应发生上效果不明显，此次研究的样本案例较少，还需要大样本高质量RCT研究来进一步证实。 研究2基于网络药理学及分子对接探讨阳和汤治疗脊柱结核的作用机制 目的:基于网络药理学及分子对接技术，筛选阳和汤治疗脊柱结核核心作用靶点，并对可能涉及到的机制进行预测，为后续机制研究提供理论基础。 方法:利用中草药系统药理学平台数据库(TCMSP)、中药高通量实验和参考数据库(HERB)、中药分子机制的生物信息学分析数据库(BATMAN-TCM)对阳和汤治疗脊柱结核的活性药物成分及有效药物靶点进行筛选，结合人类基因综合数据库(GeneCards)对靶点进行预测;利用R软件进行GO、KEGG富集分析后建立中药-活性成分-交集基因-疾病网络，采用STRING数据库进行蛋白质互作网格，最后通过Autodockvina软件完成分子对接实验。 结果:阳和汤治疗脊柱结核的471个有效活性成分、药物靶点640个、疾病靶点1119个、筛选得到的Hub基因有炎症因子IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子TNF-α等作为阳和汤治疗脊柱结核的主要作用靶点。结合GO、KEGG富集分析得到阳和汤可能通过调控AGE-RAGE信号通路、胞浆DNA传感通路(cGAS-sting通路)、HIF-1、TNF等信号通路减轻炎症反应、调节自噬、氧代谢、免疫反应等多种方式来达到治疗脊柱结核的作用;分子对接提示阳和汤中的槲皮素、亚麻酸等活性成分能够与IL-6、TNF-α、IL-1β较好的结合。 小结:阳和汤可能通过多靶点、多途径的方式来达到治疗脊柱结核的作用，为后续阳和汤治疗脊柱结核提供了理论基础。 研究3阳和汤辅助治疗阳虚型脊柱结核的临床疗效 目的：通过临床研究观察阳和汤治疗脊柱结核的临床疗效，为阳和汤治疗脊柱结核提供较为可靠的科学依据。 方法：纳入阳虚型轻型脊柱结核患者40例，随机分组对照实验，对照组20例予以规范化抗结核治疗，治疗组20例予以阳和汤+规范化抗结核治疗，观察时间3个月，在治疗前（T0）、治疗1个月（T1）、治疗2个月（T2）、治疗3个月（T3）4个时间点对两组疗效指标进行观察。对两组一般资料、疼痛评分（VAS评分）和腰部功能障碍评分（ODI评分）、炎症指标：血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、中医证候积分、中医疗效，不良反应发生率进行差异性比较，在治疗前（T0）、治疗3个月（T3）2个时间点通过对血清中T细胞亚群比例、炎症因子IL-6、TNF-α水平表达进行检测后差异性比较。 结果: （1）临床指标：一般资料上两组患者差异无统计学意义（P＞0.05）,具有可比性；VAS评分上，两组患者较治疗前均有改善，在T1、T2两个时间点治疗组VAS评分明显低于对照组（P＜0.05）,在T3时间点两组患者VAS评分趋于稳定差异无明显意义（P＞0.05）；ODI评分上，两组患者较治疗前均有改善，在T1、T2、T3时间点治疗组ODI评分均明显低于对照组（P＜0.05）,差异有统计学意义。ESR上，两组患者较治疗前均有改善，在T1、T2两个时间点治疗组ESR水平明显低于对照组（P＜0.05）,在T3时间点两组患者ESR水平趋于稳定差异无明显意义（P＞0.05）；C反应蛋白上，两组患者较治疗前均有改善，在T1、T2两个时间点治疗组C反应蛋白明显低于对照组（P＜0.05）,在T3时间点两组患者C反应蛋白水平趋于稳定差异无明显意义（P＞0.05）；在中医证候积分上，两组患者治疗后中医证积分均改善，T1、T2、T3时间点治疗组的中医证候积分明显低于对照组（P＜0.05）,差异有统计学意义；在中医疗效及不良反应发生率上，对照组治疗后中医疗效显效率30%,不良反应发生率25%；治疗组治疗后中医疗效显效率55%,不良反应发生率15%。 （2）T细胞亚群：治疗后两组患者T淋巴细胞亚群水平均明显改善;T3时间点治疗组的CD4+、CD4+/CD8+水平明显高于对照组、CD8+水平明显低于对照组（P＜0.05）,差异有统计学意义。 （3）炎症因子IL-6、肿瘤坏死因子TNF-α:治疗后两组患者治疗后IL-6、TNF-α表达水平均显著下降;T3时间点IL-6、TNF-α水平变化可发现，治疗组的IL-6、TNF-α表达水平明显低于对照组（P＜0.05）,差异有统计学意义。 小结:阳和汤联合规范化抗结核治疗治疗脊柱结核在改善患者临床症状、中医症候症状、减轻炎症反应、提高患者免疫水平方面疗效显著。 研究4cGAS-STING信号通路关键因子在脊柱结核治疗前后表达的相关性分析 目的:探讨阳和汤治疗脊柱结核与先天性固有免疫反应通路cGAS-STING的相关性。 方法:采集纳入试验的40名脊柱结核患者T0、T3时间点的晨起空腹外周血，对外周血进行PBMC单核细胞的提取，并将部分外周血及提取的PBMC细胞进行超低温储存备用，通过PCR法对单核细胞中cGAS-STING通路上的关键分子进行检测，对两组患者进行差异性比较;通过ELISA法检测血清中IFN-α及IFN-β水平表达。 结果:对两组患者进行比较，治疗组治疗后，单核细胞中cGAS、STING、TBK1、IRF3水平及血清中IFN-α、IFN-β水平较对照组均显著升高（P＜0.05）,差异有统计学意义。 小结:阳和汤可能上调cGAS-STING通路上的关键分子大量产生干扰素因子，进而增强机体适应性的免疫反应以达到治疗脊柱结核的作用。 研究5体外细胞实验 目的:通过体外细胞实验，验证阳和汤可能通过干预cGAS-STING通路来调节巨噬细胞自噬，清除结核分枝杆菌达到抗结核的作用，同时减轻了炎症反应，调节机体免疫应答水平。 方法:诱导THP-1细胞产生吞噬作用，建立经M.tb感染的THP-1巨噬细胞模型备用，将细胞模型沉默cGAS后储存备用，完成阳和汤含药血清的制备，筛选出最适浓度，通过对经M.tb感染的THP-1巨噬细胞、si-cGAS巨噬细胞、si-SCR巨噬细胞进行分组，用阳和汤含药血清、3-MA、RAPA进行干预后分成了A正常血清+M.tb感染组;B阳和汤含药血清+M.tb感染组;C阳和汤含药血清+3-MA自噬抑制剂+M.tb感染组;D阳和汤含药血清+si-SCR+M.tb感染组;E阳和汤含药血清+si-cGAS+M.tb感染组;F雷帕霉素（RAPA）+si-cGAS+M.tb感染组6组，通过PCR检测cGAS-STING通路上关键分子cGAS、STING、TBK1、IRF3、Ⅰ型IFNsmRNA的表达、自噬相关基因ATG5、Beclin-1、LL-37、LC3BmRNA的表达;Westernblot检测cGAS-STING通路相关蛋白、自噬及炎症的相关蛋白，对6组干预后的细胞进行差异性比较。 结果: （1）20％浓度为阳和汤含药血清的最佳浓度，杀菌能力强且对细胞活力影响较小，即后续实验设计的最佳浓度为20％浓度的阳和汤含药血清。 （2）PCR结果显示，与Control组比较，YHT组中cGAS、STING、TBK1、IRF3、Ⅰ型IFNsmRNA、自噬相关基因ATG5、Beclin-1、LL-37、LC3BmRNA的相对表达量显著增加（P＜0.05）;与YHT组比较，YHT+si-cGAS组ATG5、Beclin-1、LL-37、LC3BmRNA表达降低（P＞0.05）,YHT+3-MA组ATG5、Beclin-1、LL-37、LC3BmRNA表达显著降低（P＜0.05）;YHT+si-SCR组中ATG5、Beclin-1、LL-37、LC3BmRNA表达无明显差异（P＞0.05）;与YHT+si-SCR组比较，YHT+si-cGAS组cGAS、STING、TBK1、IRF3、Ⅰ型IFNsmRNA的表达无明显差异（P＞0.05）。 （3）WB检测结果:与Control组比较，YHT组、YHT+si-cGAS组、RAPA+si-cGAS组中ATG5、Beclin-1、LL-37、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达明显上调（P＜0.05）,炎症相关IL-6、TNF-α蛋白表达明显降低（P＜0.05）;相比于Control组，YHT、YHT+3-MA、YHT+si-SCR组中cGAS、STING、TBK1、IRF3、Ⅰ型IFNsmRNA的蛋白表达显著上调（A＜B、A＜C、A＜D,P＜0.05）;与YHT+si-SCR组相比较,YHT+si-cGAS组cGAS、STING、TBK1、IRF3、Ⅰ型IFNsmRNA蛋白表达水平无明显差异（P＞0.05）。 （4）相比于Control组，YHT组中细胞菌落计数显著减少（P＜0.05）;相比于YHT+3-MA组，YHT组菌落计数显著减少（P＜0.05）;相比于YHT+si-cGARs组，YHT+si-SCR（对照干扰siRNA）菌落计数减少明显（P＜0.05）。 （5）相比于Control组，YHT组自噬体与溶酶体融合数量显著增多（P＞0.05）,YHT+3-MA组自噬体与溶酶体融合数量少;相比与YHT组，YHT+si-SCR与组中自噬体与溶酶体融合数量差异无统计学意义（P＞0.05）,YHT+si-cGAS组中自噬体与溶酶体数量明显减少（P＜0.05）。 小结:阳和汤可以通过上调cGAS-STING通路来促进巨噬细胞自噬清除结核分枝杆菌，减轻炎症反应调节机体免疫平衡。
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