摘要
目的本课题主要研究氟暴露对青春期雄性小鼠生殖发育的影响，探讨研究内质网应激在青春期氟暴露损害小鼠睾丸发育和精子生成的作用。 方法本研究分为体内实验和体外实验两部分进行。在体内实验中，将36只健康的ICR雄性小鼠随机分为两组：对照组和暴露组。对照组给予超纯水，NaF暴露组分别饮用含25mg/L和50mg/LNaF的超纯水，饲养70天后处死小鼠。在体外实验中，将小鼠GC-1spg暴露于0、1、2、3mM剂量的NaF24小时之后收集细胞。本研究取小鼠单侧附睾进行精子计数；眼球血检测血清睾酮水平；Hamp;E染色观察小鼠睾丸组织学形态变化；TUNEL染色检测睾丸生殖细胞凋亡；免疫组化方法检测睾丸内质网应激标志分子GRP78的表达；CCK-8和流式细胞术检测细胞活力和凋亡；转录组学检测细胞经NaF暴露后激活的信号通路基因富集分析情况；使用Westernblot和qRT-PCR技术来检测内质网应激以及钙离子通道相关蛋白和mRNA的表达；Fluo-4AM、Mag-Fluo-4AM和Rhod-2AM钙离子探针，检测细胞质、内质网和线粒体的钙离子含量；JC-1探针被用来测量细胞线粒体膜电位，分离线粒体和细胞质并分别检测AIF和Cyt-c的表达；DCFH-DA探针被用来检测细胞ROS水平；分光光度法检测SOD酶的活性以及GSH和MDA的含量。 结果在体内实验中，NaF暴露组小鼠精子数量和血清睾酮水平相比较于对照组有明显下降；Hamp;E染色显示NaF暴露组睾丸生精小管管壁变薄，周围有间质细胞丢失，成熟期的生精小管比例明显减少；TUNEL染色显示NaF暴露组睾丸生殖细胞凋亡细胞数增加，生精小管内阳性细胞数和阳性小管数均显著增加；免疫组化显示，与对照组相比，NaF暴露组睾丸生殖细胞中表达GRP78蛋白阳性的细胞数增加；分光光度法显示，NaF暴露组睾丸中SOD酶的活性以及GSH的含量相比对照组有明显的降低，而MDA含量相较于对照组明显增加；qRT-PCR显示NaF暴露组小鼠睾丸中GRP78、GRP94、CHOP、ATF-6α、ATF-4、XBP-1的mRNA表达增加；Westernblot显示NaF暴露组GRP78和p-PERK、p-IRE1α、p-eIF2α、p-JNK、XBP-1、ATF-6α、ATF-4、CHOP的蛋白表达增强。在体外实验中，GC-1spg在NaF暴露后细胞活力显著下降，细胞总凋亡率明显增加。转录组学结果分析中，GO富集显示NaF暴露主要影响蛋白质融合和细胞代谢，KEGG信息通道富集分析NaF暴露会激活内质网应激通道和钙通道。qRT-PCR检测结果显示，NaF组小鼠GC-1spg细胞中GRP78、GRP94、CHOP、ATF-6α、GRP75、VDAC1、MCU的mRNA表达显著增加。WesternBlot显示NaF组GRP78和p-PERK、p-IRE1α、p-eIF2α、XBP-1、ATF-6α、ATF-4、CHOP、CleavedCaspase-3、p-IP3R、GRP75、VDAC1和MCU的蛋白表达增加。钙离子探针Mag-Fluo-4AM检测发现NaF处理的细胞，其内质网钙离子浓度明显下降，Fluo-4AM检测发现NaF处理的细胞，其细胞质钙离子浓度显著上升，Rhod-2AM检测发现NaF处理的细胞，其线粒体钙离子浓度显著上升。进一步研究发现，NaF暴露组细胞线粒体AIF和Cyt-c的蛋白表达显著下降，而细胞质的AIF和Cyt-c蛋白表达明显上升。荧光探针DCFH-DA检测显示，NaF暴露组ROS水平明显上升，并且具有剂量效应。分光光度法显示，NaF暴露组细胞内SOD酶活性和GSH含量明显降低，MDA含量明显增加。 结论NaF暴露会引起青春期小鼠睾丸损伤和精子数下降，诱导睾丸精原细胞凋亡。NaF暴露会引发内质网应激，促使精原细胞内质网钙离子通路打开，释放出大量内质网钙离子进入细胞质，最后引发线粒体钙过载，促使细胞发生氧化应激，线粒体释放AIF和Cyt-c等凋亡因子至细胞质中，诱发细胞凋亡。综上所述，青春期氟暴露可能通过激活睾丸内质网应激，促使内质网钙离子释放，引起线粒体钙过载，进而诱导ROS增加、MMP降低，导致线粒体释放AIF和Cyt-c等凋亡因子至细胞质中，从而诱发睾丸生殖细胞凋亡，损害精子发生。
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