摘要
柑橘作为我国重要水果，在采后容易受到病原菌为指状青霉(Penicilliumdigitatum)的绿霉病侵害，几乎占采后损失的90％。铜制剂已广泛应用于多种病害的防治，前期研究发现硫酸铜也能用于绿霉病的防治。本研究通过扩建和筛选指状青霉突变体库，重测序检索到影响指状青霉对铜离子敏感的铁质膜通透性基因Pdftr1(PenicilliumdigitatumPd1Plasmamembraneironpermease),利用同源重组法对基因Pdftr1进行敲除和回补，分别从离体实验和接种果实探究Pdftr1在指状青霉中的作用机制，主要结果如下: 1、克隆到影响指状青霉对铜离子表现敏感性的基因Pdftr1。通过优化农杆菌介导的指状青霉转化体系，共获得1200个指状青霉转化子。分别用含0.08g/L和0.5g/L硫酸铜的PDA培养基从2600个转化子中筛选敏感型和抗性转化子，最终筛选获得2个敏感性转化子P7-64和P11-52,对其进行重测序，在转化子P7-64的T-DNA插入位点处检索到基因Pdftr1。通过同源重组法对指状青霉进行基因Pdftr1的敲除和回补，分别获得60个敲除转化子和50个回补转化子。 2、Pdftr1基因介导柑橘指状青霉对铜离子的敏感性研究。将指状青霉P44、敲除菌株△Pdftr1和回补菌株△Pdftr1-f分别在不同浓度的硫酸铜下培养，Pdftr1缺失突变体在硫酸铜培养下生长能力显著减弱，表明基因Pdftr1介导指状青霉对铜离子的敏感性。进一步实验表明基因Pdftr1缺失菌株对生产上常见的四种无机铜制剂表现敏感，而对有机铜制剂不敏感。 3、Pdftr1基因介导柑橘指状青霉的生长发育及致病性研究。将指状青霉P44、敲除菌株△Pdftr1和回补菌株△Pdftr1-f在不同的离体条件下培养，结果表明基因Pdftr1与指状青霉菌落形态、生长速率、氧化胁迫、细胞壁完整性和Na+胁迫以及Mg2+、Fe2+、Fe3+和Zn2+敏感性无关，而可能与K+、咪鲜胺和丙环唑抗性有关，与Al3+敏感性有关。进行致病性分析发现接种4d后ΔPdftr1的果实病斑直径与P44、△Pdftr1-f无显著差异，表明该基因不参与指状青霉致病力。但果实接种不同菌液再接种3g/L硫酸铜，4d后△Pdftr1病斑直径(2.13±0.49cm),显著低于P44(5.6±0.89cm)和△Pdftr1-f(4.55±0.40cm),在柑橘果实上仍表现出显著高于P44和△Pdftr1-f的铜敏感性。 综上所述，通过铜离子对指状青霉的作用靶点研究，为后续绿色防控药剂的研发提供了理论基础和新的方向。
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