摘要
微藻富含蛋白质、色素、脂肪酸等高价值化合物，是目前最具潜力的食品资源之一。微藻食品市场对于优质藻株的需求逐年加大，当前无规律的物理、化学突变手段获得的藻株难以满足市场需求，利用基因工程手段对微藻进行定向改造是目前的研究热点之一。模式微藻莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)可以乙酸盐为碳源进行异养培养,其基因组清晰、基因操作成熟,是理想的生物反应器。因此，本文以莱茵衣藻为材料，首先进行了自养、异养生理分析实验，然后对这两种培养模式下的莱茵衣藻进行转录组分析,探讨莱茵衣藻异养生长下的生长代谢模式及分子调控机制。随后利用Crispr/Cas9RNP、RNAi和过表达这几种基因工程技术，以期获得含高含量类胡萝卜素的莱茵衣藻浅色突变株。主要结果如下: (1)对莱茵衣藻自养、异养两种培养条件下的藻细胞进行生理生化数据测定，结果表明，莱茵衣藻在异养培养下细胞密度最高可达到9.01×106cells/mL。异养培养下的衣藻细胞可溶性蛋白质和总氨基酸含量显著增加。通过转录组分析短期自养转变为异养后衣藻的基因水平和代谢途径变化发现异养下的衣藻细胞更多的通过C4、CAM途径固定碳，通过上调淀粉代谢、TCA循环和线粒体氧化磷酸化这几个途径，营养代谢和能量传递得到增强。 (2)Mg-原卟啉Ⅸ单甲酯环化酶是叶绿素合成途径的关键酶之一，应用CRISPR/Cas9RNP技术对MPE基因进行敲除，并成功进行了体外验证，体内实验未能获得敲除株。通过转化RNAi质粒，获得了转化子R1和R2。但R1和R2无法正常生长并用于后续实验,推测MPE对莱茵衣藻的正常生长起着重要作用。 (3)β-类胡萝卜素酮化酶(BKT)是莱茵衣藻类胡萝卜素合成途径中的关键酶，选择莱茵衣藻与红法夫酵母(Phaffiarhodozyma)的BKT基因进行过表达，并获得过表达株C18和P1。对野生株WT,过表达株C18和P1进行异养培养,测定其生理生化数据。结果表明这三个藻株均可正常生长，总叶绿素含量没有显著性差异。C18和P1的总类胡萝卜素含量在第4天达到最大值，分别是WT的2.13倍和2.20倍。同样在第4天，C18和P1的虾青素含量分别是WT的1.21倍和1.27倍，β-类胡萝卜素含量分别是WT的1.84倍和1.11倍。 (4)对过表达株C18和P1进行转录组与代谢组分析，探索BKT基因的过表达对莱茵衣藻其它代谢途径基因表达的影响。在C18中，类胡萝卜素通路中仅有BKT和LCYE基因表达上调，而P1藻株中，BKT,LCYE,ZDS,CHYB基因表达均上调。此外，转录组结果表明C18与P1藻株中的叶绿素合成、萜类骨架合成，糖酵解和磷酸戊糖途径中大部分基因的表达水平均上调。结合代谢组发现角黄素含量下调，同时大部分差异代谢物和基因富集于氨基酸、脂肪酸合成和代谢通路。 综上所述，异养莱茵衣藻可以获得更高的生物量和蛋白质含量，且过表达获得的藻株在异养培养下，类胡萝卜素含量显著提高。本研究为了解微藻的异养培养和高价值可食用藻株的基因工程筛选提供了有价值的理论基础。
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