摘要
茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze,2n=30]是我国具有重要经济价值的多年生木本植物，因为其染色体较小，茶树细胞遗传学研究进展缓慢。染色体是生物主要遗传物质的载体，是细胞遗传学的重要研究对象。目前，荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)广泛应用于细胞遗传学研究领域，它可以准确地将带有修饰的探针精准定位在染色体上，从而有助于染色体识别和基因的精准定位。随着分子生物学技术的飞速发展，茶树多个品种的全基因组测序数据已经发布，为染色体的研究提供了数据支持。为了推进茶树细胞遗传学的发展、提高茶树染色体分析的精准度和建立茶树物理遗传图谱，本文拟系统开展茶树染色体制片技术优化、茶树专用荧光原位杂交探针开发，进而构建茶树荧光原位杂交技术体系。此外，还观测了茶树花粉母细胞减数分裂染色体行为。主要研究结果如下: (1)茶树体细胞和生殖细胞染色体制片技术优化:①选择四个茶树品种的茶籽新生根尖、一年生扦插苗新生根尖和芽尖为材料，设置3种预处理方法和不同时长的酶解时间，获得最佳的“酶解去壁滴片法”为:取1～2cm茶籽新生根尖作为实验材料，用N2O预处理1.5～2h,用2％纤维素酶果胶酶溶液在37℃条件下酶解60～70min。②选择三个茶树品种不同发育时期的花粉母细胞进行直接压片，确定了当花药呈黄白色时且花蕾直径处于4.2mm～5.0mm时，花粉母细胞处于减数分裂旺盛时期，此时细胞分裂相最多，为取材的最佳时期。这两种制片方法得到的染色体其分散度好、清晰度高，均适用于开展后续的荧光原位杂交实验;此外，花粉母细胞直接压片法也适用于茶树减数分裂染色体行为观察。 (2)茶树专用荧光原位杂交探针开发:根据已发布的‘舒茶早’(SCZ)和‘龙井43’(LJ)基因组数据库，基于5SrDNA序列、简单重复序列和复杂重复序列设计了3类寡核苷酸探针，经筛选并合成了20个探针用于FISH实验，11个探针有杂交信号，大部分位于染色末端，其中LJ-308、LJ-636、LJ-694和LJ-1009探针可产生10个信号，5S1和5S2可在7条染色体上产生9个信号，SCZ-39和LJ-232探针可分别产生9个和1个信号;SCZ-3、SCZ-5,SCZ-7均可以在两条染色体上产生信号;同时成功将LJ-308、LJ-636、LJ-694和LJ-1009探针定位在2、3、8、11号染色体末端上。此外，构建了5S2、SCZ-39、LJ-636混合探针应用于不同品种茶树染色体分析，可以一定程度区分不同品种茶树染色体差异。 （3）茶树花粉母细胞减数分裂染色体行为观察:对‘福鼎大白茶’、‘黄金芽’、‘御金香’三个无性茶树品种的花药进行压片、染色和观测，结果发现:这三个无性茶树品种的花粉母细胞减数分裂过程基本正常，但同时也观察到了一定频率的细胞融合、落后染色体、染色体桥、微核、减数分裂中期染色体提前向两极移动、不均等分裂、第二次减数分裂不同步等异常现象。其中以“细胞融合”发生的频率最高，且主要发生在第一次减数分裂的前期，但在‘福鼎大白茶’的其他时期中也有少量观察到。以上结果表明:三个无性茶树品种的遗传稳定性都较好。
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