摘要
绿胚中叶绿体可进行光合作用，为胚胎早期发育提供所需氧气和能量;另一方面,绿胚中叶绿体发育对胚胎发生、种子萌发、植物营养生长等生理过程都有重要影响。此外，胚胎中叶绿体发育也是胚正常发育和种子品质形成的关键因素。油菜等作物胚胎中如果缺少叶绿素，会导致不饱和脂肪酸、蛋白质等含量显著下降，严重影响种子品质[1]。深入研究胚胎叶绿素合成不仅可以解释绿胚形成机制，对改良绿胚作物具有重要意义。作为种子发育调控的关键转录因子，LEAFYCOYLEDON1(LEC1)可以促进拟南芥叶绿素在子叶中的生物合成，但其作用机制尚不清楚。与拟南芥不同，水稻等禾本科植物胚中缺少叶绿素合成的能力。然而，是何机制决定了禾本植物胚中不能积累叶绿素，目前仍不明了。本研究发现，水稻LEC1同源基因OsNF-YB7的功能丧失导致水稻胚中叶绿素异常积累，表明OsNF-YB7在调控水稻胚胎叶绿素生物合成中的作用与拟南芥LEC1相反。进一步的功能研究发现，OsNF-YB7与叶绿素生物合成的关键调节因子GOLDEN2-LIKE(GLK)存在物理互作。本研究通过遗传学和分子生物学等手段解析了OsNF-YB7和OsGLK1互作调控绿胚形成的分子机制。主要研究结果如下: 1.透射电镜、荧光共聚焦显微镜观察等细胞学分析技术对osnf-yb7突变体胚胎进行表型分析，结果表明osnf-yb7突变体绿胚表型是由于胚中叶绿素积累导致。 2.通过RNA-seq、qRT-PCR等方法发现叶绿素合成及光合作用相关基因在osnf-yb7胚胎中表达上调，表明OsNF-YB7负调控光合作用及叶绿素生物合成的相关基因。 3.转录组及qRT-PCR实验结果显示OsNF-YB7抑制胚中OsGLK1表达。通过ChIP-qPCR和双荧光素酶报告(DLR)实验证明OsNF-YB7在OsGLK1启动子富集并抑制其活性。 4.利用CRISPR/Cas9系统，成功获得了osnf-yb7osglk2双突突变体以及osnf-yb7osglk1osglk2三突突变体，对其进行表型分析发现，当三个基因上都突变时，胚中叶绿素积累显著减少。进一步构建了OsGLK1过表达系(OsGLK1-OX),其胚中显著积累叶绿素。以上结果表明osnf-yb7介导的叶绿素积累部分依赖于OsGLKs生物学功能。 5.对OsGLK1-OX和osnf-yb7胚胎转录组数据分析发现，OsGLK1与OsNF-YB7拮抗调控胚中叶绿素合成和光合相关基因表达。进一步对二者ChIP-seq数据分析发现,OsNF-YB7和OsGLK1结合到共同靶标的相同基序。 6.通过酵母双杂交，双分子荧光互补等生化实验证明OsNF-YB7与OsGLK1存在物理互作。进一步利用DLR和EMSA方法证明OsNF-YB7抑制OsGLK1生化活性。 综上所述，我们认为OsNF-YB7在水稻胚胎叶绿素生物合成调控中发挥着双重作用。首先，它行使作为转录因子的功能，对下游基因进行抑制;其次，它可以和其他转录因子互作，如OsGLKs干扰其激活叶绿素生物合成和光合作用相关基因的能力。
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