摘要
捻转血矛线虫是一种寄生于牛羊等反刍动物皱胃内靠采食宿主血液为生的一种危害十分严重的寄生线虫。其防控长期以来主要依靠化学药物，造成全球耐药性的出现，并且市面上商业化疫苗十分短缺，使得捻转血矛线虫病成为危害牛羊等经济动物最为严重的疾病之一。为了对其进行更细致的了解与有效的防控，当前利用高度发达的生物信息学技术对捻转血矛线虫的各类组学进行了测定，分析得到了众多的药物靶标及疫苗候选分子，但是寄生期尤其是对宿主危害严重的吸血寄生期体外培养体系一直未曾建立，阻碍了基因操作技术的建立，导致候选分子及靶标的验证工作停滞不前。 本研究从捻转血矛线虫寄生期所需营养物质入手，改善基础培养基并明确脱纤维蛋白血的最适浓度;此后重点关注于其吸血后需要解除分解血红蛋白后代谢出的游离血红素毒性这一特点，分析鉴定了其具有生成血红素结晶的解毒途径及其特性;确定了添加抗氧化剂还原性谷胱甘肽(L-GSH)与维生素C(Vc)的最适浓度，最终首次使体外培养中存活L4幼虫几乎全部发育至L4中期，部分发育至L4末期，具体研究内容包括如下几个方面: (1)基础培养基的改进及脱纤维蛋白血的添加量 首先以L3-L4期发育率为判断标准进行实验，确定M-199在pH6.5作为L3-L4发育的培养条件。然后根据以往所应用的基础培养基，配置NCTC-109与LB两种不同培养基的混合培养基，以幼虫体长体宽及尾部膨大率为判断依据，确定NCTC-109∶LB为1∶2的混合培养基为幼虫自进入L4的最适培养基。基于此我们对幼虫生长发育所必须的脱纤维蛋白血(DefibrinatedbloodDFB)浓度进行了梯度实验，发现DFB≥7.5％时开始有幼虫发育至L4末期，表明DFB是幼虫生长发育所必须的;12.5％DFB浓度下培养的幼虫发育至生殖系统各器官清晰可辨的L4末期数量最多，因此确定该浓度为最适培养浓度;但是在DFB≤5％时，幼虫很快出现了大量死亡，这又提示血液中可能含有某种不利于幼虫生存的因素。 (2)吸血期捻转血矛线虫生成血红素结晶的解毒途径鉴定 基于少量添加DFB后L4期幼虫出现死亡，分析原因可能与游离血红素造成机体氧化损伤有关，因此探索宿主体内吸血后捻转血矛线虫应对其损伤的解毒机制，以期为后续体外培养体系的改善提供指导意见。首先运用多种显微镜及光谱扫描结果发现其肠道合胞体具有生成血红素结晶的解毒途径，体外实验验证捻转血矛线虫体内确实具有促进血红素结晶生成的蛋白和脂质，并且体外培养的幼虫也具有生成血红素结晶的解毒途径，且该途径可以被甲氟喹(100nM)奎宁(10nM和100nM)进行有效的抑制。 (3)抗氧化对体外培养的捻转血矛线虫吸血后的影响 为了了解不同DFB浓度下幼虫存活率的差异并进行改良，进行了如下实验(1)对不同DFB浓度梯度下L4s体内血红素结晶生成量及活性氧(Reactiveoxygenspecies:ROS)含量进行检测，发现2.5％DFB环境中几乎不生成血红素结晶，随后血红素结晶的生成量与脱纤维蛋白血浓度呈正相关，ROS含量在不同浓度下呈“钟型”;(2)为进一步改良培养基，添加具有分解代谢血红素及抗氧化功能的L-GSH结果显示其显著降低了肠道ROS的含量，进而降低了肠道细胞核的损伤，同时显著提高了其存活发育率，在最适浓度为0.3mg/mL条件下，存活的L4幼虫几乎全部发育至L4中期，50％左右的L4可以发育至L4末期;(3)通过添加仅具有抗氧化性的Vc验证了仅需要适当降低其体内ROS的含量即可促进L4s的生长发育，Vc浓度为200nM时与L-GSH浓度为0.3mg/mL时达到相同的促进效果。 综上所述，本研究在自行配置的混合培养基的基础上首次对DFB进行浓度梯度实验并确定了其最适浓度，其次首次鉴定到宿主体内吸血期捻转血矛线虫通过生成血红素结晶的解毒途径来趋利避害的利用血液，而后依据其原理确定抗氧化剂的最适添加量，最终首次完成了体外培养的四期幼虫几乎全部发育至L4中期，部分发育至L4末期的进步，这一结果显著促进了捻转血矛线虫体外培养体系的发展。
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