摘要
类胡萝卜素是由40个碳组成的一类天然类异戊二烯色素，一般呈现红色、黄色或橙色。我们前面的研究结果表明，甘蓝型油菜类胡萝卜素裂解双加氧酶4基因(BnaC3.CCD4)功能的丧失会使花瓣中紫黄质显著增加，花色由白色变为黄色，但花色的变异是否是BnaC3.CCD4作用于紫黄质而导致的暂不清楚。在甘蓝型油菜中，Bna.CCD4基因存在BnaA1.CCD4、BnaA8.CCD4、BnaC1.CCD4、 BnaC3.CCD4四个拷贝，其表达模式存在分化。将四个拷贝分别在黄花甘蓝型油菜中表达时，导致转基因材料的花色明显不同;利用CRISPR-Cas9技术将甘蓝型油菜中Bna.CCD4基因敲除时，不同突变体材料之间类胡萝卜素含量出现显著差异。因此四个蛋白的酶活特性出现了分化，但具体的分化特点有待进一步研究。基于以上问题，本研究通过生物信息学预测和体外酶活等方法，对甘蓝型油菜的四个CCD4蛋白进行研究,进一步在分子水平上揭示Bna.CCD4的作用模式以及可能存在功能分化的原因。主要研究结果如下: 1.生物信息学分析:DNA序列和氨基酸序列分析结果表明，甘蓝型油菜4个CCD4基因可以被分为两组，BnaA1.CCD4和BnaC1.CCD4为第一组，BnaA8.CCD4和BnaC3.CCD4为第二组，组内与组间的序列相似性分别为97.0％和88.0％。系统进化分析结果表明，AtCCD4与Bna.CCD4的同源关系最近。结构域分析结果表明，4个Bna.CCD4蛋白都含有RPE65结构域。保守基序分析结果表明,4个蛋白在基序组成上不存在差异;将Bna.CCD4的保守基序与AtCCD4、CitCCD4、GjCCD4等的保守基序进行对比发现，其与AtCCD4具有相同的基序组成。 2.通过序列同源性建模建立了BnaA1.CCD4、BnaA8.CCD4、BnaC1.CCD4、BnaC3.CCD4蛋白的三维结构，并与全反式紫黄质、β-胡萝卜素、叶黄素等11种类胡萝卜素底物进行了分子对接。结果表明，BnaA8.CCD4和BnaC3.CCD4具有相似的底物亲和性，亲和力最高三种物质分别是9-顺式紫黄质、β-隐黄质、玉米黄质;BnaA1.CCD4和BnaC1.CCD4具有相似的底物亲和性，亲和力最高三种物质分别是全反式新黄质、9-顺式新黄质、叶黄素，而4个Bna.CCD4蛋白都表现出对ζ-胡萝卜素、全反式番茄红素和八氢番茄红素较低的亲和力。 3.构建了Bna.CCD4基因的原核表达载体pET-28a-Bna.CCD4,确定其最佳诱导条件为16℃,20h,0.2mmol/LIPTG,并建立了体外酶活反应体系。体外酶活反应结果显示，4个Bna.CCD4蛋白都能在体外裂解叶黄素、玉米黄质、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素(C40)以及8-阿朴-β-胡萝卜醛(C30)。GC-MS和LC-MS分析结果显示，Bna.CCD4可以在9,10位碳双键裂解β-胡萝卜素和8-阿朴-β-胡萝卜醛，产生C13的挥发物以及C14、C17的双醛物质。 4.利用Lineweaver-Burk方程测定了BnaA1.CCD4、BnaA8.CCD4、BnaC1.CCD4、BnaC3.CCD4蛋白对于β-胡萝卜素和叶黄素的亲和性以及催化效率。结果表明，在底物亲和性方面，对于β-胡萝卜素、叶黄素的亲和性排序分别是BnaA1.CCD4＞BnaA8.CCD4＞BnaC1.CCD4＞BnaC3.CCD4以及BnaC3.CCD4＞BnaC1.CCD4＞BnaA8.CCD4＞BnaA1.CCD4。在底物催化效率方面，对于β-胡萝卜素、叶黄素的催化效率排序分别是BnaA1.CCD4＞BnaC1.CCD4＞BnaA8.CCD4＞BnaC3.CCD4以及BnaC3.CCD4＞BnaC1.CCD4＞BnaA1.CCD4＞BnaA8.CCD4。 5.用定点突变的方法在BnaC3.CCD4蛋白中产生与BnaA8.CCD4相同的9个点突变，然后对突变体蛋白进行体外酶活研究。结果显示，第173和389位氨基酸的突变可以显著提高BnaC3.CCD4对于β-胡萝卜素的催化效率，这表明这两个位点的突变导致了BnaA8.CCD4与BnaC3.CCD4对于β-胡萝卜素催化效率的差异。
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