摘要
大口黑鲈蛙虹彩病毒(LargemouthbassRanavirus,LMBV)是危害我国大口黑鲈养殖业的重要病原之一。为了分离LMBV并研究其感染大口黑鲈的致病性、病毒组织分布及病毒载量变化。本研究于2022年3-7月在广东省佛山市采集到患病大口黑鲈样品161份，通过荧光定量PCR(qPCR)检测和普通PCR验证，鉴定到81份LMBV阳性样品。81份LMBV阳性样品接种鲤上皮瘤细胞(Epitheliomapapulosumcyprini,EPC),发现33个样品导致EPC细胞出现病变效应(Cytopathiceffect,CPE)。扩增33株LMBV分离株的四个基因并进行测序分析，发现33株LMBV的四个基因序列同源性＞99％。将33株LMBV接种草鱼性腺细胞(Grasscarpovary,GCO)和大口黑鲈心脏细胞(Micropterussalmoidesheartcells,MSH),发现这两种鱼类细胞对LMBV敏感性低于EPC细胞。挑选一株LMBV,通过腹腔注射和浸泡感染大口黑鲈,发现腹腔注射组大口黑鲈死亡率达到80％,浸泡感染组大口黑鲈死亡率达到76％。对不同组织中病毒载量进行检测，发现注射感染组和浸泡感染组大口黑鲈的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、大脑、小肠1-5天的病毒载量逐渐上升，注射感染组心脏的病毒载量最高，脑的病毒载量最低;浸泡感染组肾脏的病毒载量最高，脑的病毒载量最低。主要研究结果如下: 1、LMBV的鉴定及接种EPC细胞的病变观察 2022年3-7月在广东省佛山市采集患病大口黑鲈样本161份，通过qPCR检测LMBV,鉴定到LMBV阳性样品81份。将81份阳性样品通过普通PCR扩增LMBV的衣壳蛋白基因MCP,进一步确定81份样品为LMBV阳性，阳性率达到50.31％。将81份LMBV阳性样品接种EPC细胞，观察细胞CPE,结果显示有33个LMBV阳性样品导致EPC出现CPE。 2、33株LMBV的四个基因扩增及测序分析 33份LMBV阳性样品接种EPC细胞，待EPC细胞出现CPE,收集上清液，扩增LMBV的四个基因:衣壳蛋白基因MCP,十四烷基化膜蛋白基因MMP,DNA聚合酶基因DNApol,DNA甲基转移酶基因dnmts。对四个基因的PCR扩增产物进行测序，对测序结果进行同源性比对分析，发现33株LMBV的MCP基因序列同源性达到100％;MMP基因序列同源性达到100％;DNApol基因序列同源性达到100％;dnmts基因序列同源性达到99％。根据同源序列比对结果，可以判断33株LMBV分离株为同一株LMBV。 3、LMBV对两种鱼类细胞的敏感性实验 为探究LMBV两种鱼类细胞的敏感性，将能引起EPC细胞病变的33份阳性样品接种GCO细胞和MSH细胞。结果显示:接种GCO细胞后，第6天开始出现CPE,观察CPE10天，共有12个样品导致GCO细胞出现CPE;接种MSH细胞后，第5天开始出现CPE,观察CPE10天，共有16个样品导致MSH细胞出现CPE。结果表明，GCO和MSH细胞对LMBV的敏感性低于EPC细胞。 4、LMBV对大口黑鲈的致病性及组织病毒载量研究 挑选一株LMBV分离株，测定LMBV的病毒滴度为TCID5o=106/ml。取健康大口黑鲈120条，分为4组，每组30条。实验组通过腹腔注射和浸泡的方式感染大口黑鲈，对照组采用PBS对大口黑鲈腹腔注射和浸泡作为对照。每天观察大口黑鲈的死亡情况，共观察15天。结果显示腹腔注射感染组在第6天开始死亡，15天死亡率达到80％;浸泡感染组第7天开始死亡，15天死亡率达到76％,对照组均没有出现死亡。 为探究LMBV在大口黑鲈组织器官中病毒载量，取120条健康大口黑鲈，分为4组，实验组通过腹腔注射和浸泡的方式感染大口黑鲈，对照组采用PBS对大口黑鲈腹腔注射和浸泡作为对照。感染后1-6天，每天从各组取5条鱼采集肝脏、脾脏、肾脏、心脏、脑、小肠各1g,提取组织DNA,采用qPCR检测各组织中的病毒载量，绘制各组织病毒增殖曲线。结果显示腹腔注射组1-5天，所有组织中的病毒载量均呈上升趋势，并且在第五天达到峰值。在第5天，注射感染组心脏病毒载量显著高于其他组织，达到5.14×105拷贝数/mg,脑的病毒载量最低，仅有6.94×102拷贝数/mg;浸泡感染组1-5天，所有组织病毒载量均呈上升趋势，在第5天，肾脏的病毒载量最高，达到8.20×105拷贝数/mg,脑的病毒载量最低，仅有7.30×102拷贝数/mg。对照组均没有检测到LMBV。
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