蝉花是麦角菌科真菌大蝉草CordycepscicadaeShing的蝉棒束孢菌寄生在山蝉CicadafamataDist.幼虫上的真菌孢梗束或子座及幼虫尸体的干燥复合体，广泛分布于我国秦岭-淮河以南的多个省市区，主要含有核苷酸、氨基酸、多糖类等成分。目前2018年版《湖北省中药材质量标准》中对其质量控制指标仅有性状、薄层鉴别、水分和灰分等，尚无显微鉴别和含量测定等指标，本研究将完善蝉花的质量标准，为该药材的质量控制提供科学依据。蝉花具有调节免疫、保护肾脏、降低血糖、抗疲劳等作用，但其对激素的调节作用及作用机制尚不明确。因此，本研究旨在建立蝉花质量控制标准，初步明确其药效物质基础，并探究其对睾酮分泌的影响，为其临床应用奠定基础。 目的:收集不同产地的蝉花药材，对其进行系统的质量评价，为蝉花药材质量标准的建立提供依据。同时，构建体外和体内模型，筛选蝉花促进睾酮分泌的有效部位和有效成分，探讨对睾丸间质细胞生长以及睾酮合成的影响及机制。 方法:（1）收集安徽、湖北、浙江等主要产地的蝉花样品42批，通过性状鉴定、显微鉴定、薄层色谱、含量测定、指纹图谱以及水分、灰分等指标的检测，系统评价药材质量。 （2）通过Percoll密度梯度离心法分离睾丸间质细胞，经3β-HSD染色鉴定纯化细胞，构建原代大鼠睾丸间质细胞模型，结合MTT法检测蝉花对睾丸间质细胞生长的影响，Elisa法检测蝉花对睾酮分泌的影响;采用转录组学筛选出差异基因，GO功能注释和KEGG富集分析促进睾酮分泌作用的可能靶点和通路;并通过RT-PCR、WesternBlot实验，验证蝉花对睾酮合成酶、cAMP-PKA和MAPK等相关信号通路的影响。 （3）采用腹腔注射氢化可的松构建肾阳虚小鼠模型，观察蝉花对肾阳虚小鼠的交配能力、睾丸组织形态、和血清中睾酮含量的影响，以及检测睾丸组织类固醇快速调节蛋白（Steroidogenicacuteregulatory,StAR）表达量，并从肝肾功能等方面评价蝉花的毒性作用。 结果:（1）在2018年版《湖北省中药材质量标准》已有的性状、薄层鉴别、检查项、浸出物等蝉花质量控制指标中，新增了显微鉴别和含量测定，以菌丝、孢子、刚毛、毛窝、体壁碎片等结构作为蝉花药材的显微特征;同时建议蝉花药材含水量不超过10.0％;总灰分含量不超过11.0％;酸不溶性灰分含量不超过6.5％;热水溶性浸出物含量不低于28.0％;6种核苷类成分的总量不得少于0.26％,建立了不同产地蝉花药材的HPLC指纹图谱。 （2）25-100μg/mL浓度范围内的蝉花水提、甲醇、多糖、去多糖部位作用48h内均能促进睾丸间质细胞的增殖，鸟苷、肌苷、尿苷、腺苷、N6-（2-羟乙基）腺苷等核苷类成分在50μM浓度下，对细胞无明显影响;蝉花水提物、甲醇提取物及主要核苷类成分鸟苷都能显著促进睾酮分泌。 转录组学GO功能富集结果显示，蝉花水提物和鸟苷促进睾丸间质细胞促睾酮分泌的作用机制可能与类固醇生物合成过程等相关。对与激素相关的37个核心靶点进行KEGG通路富集分析结果表明，蝉花水提物和鸟苷主要通过cAMP信号通路、类固醇激素的生物合成通路等促进睾酮分泌，通过TNF信号通路等调节免疫，筛选与激素合成相关的差异基因进行验证。 WesternBlot结果表明:蝉花水提物能促进CYP17A1和StAR睾酮合成酶蛋白的表达;促进转录因子NR5A1、CREB蛋白的表达;促进P-PKA/PKA、P-JNK/JNK蛋白的表达。其中StAR的促进作用可被抑制剂H89和SQ22536所抑制。鸟苷能促进CYP17A1和StAR的蛋白表达。 （3）体内实验表明，蝉花水提物低剂量组能恢复氢化可的松造成的肾阳虚，改善肾阳虚小鼠的交配能力，提高血清中睾酮的含量，促进睾丸组织StAR蛋白的表达，对小鼠肝肾功能均无明显影响。 结论:蝉花药材的显微鉴别、水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物和核苷类成分含量可以作为其质量参考标准，蝉花提取物能促进睾丸间质细胞的睾酮分泌，鸟苷是其主要活性成分之一，作用机制主要表现为促进睾酮合成酶StAR和CYP17A1等蛋白表达，基于转录组学及后期验证发现，蝉花也能促进cAMP-PKA和MAPK相关通路蛋白的表达。同时，蝉花能恢复肾阳虚小鼠的交配能力，且对肝肾功能无明显的副作用。
NETL
