摘要
目的:本研究旨在优选化结消瘤颗粒(HuajieXiaoliuGranule,HJF)的制备工艺及质量标准;建立荷瘤小鼠模型，探究化结消瘤颗粒体内对结肠癌的干预作用及其潜在的作用机制;运用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用(UPLC-QTOF-MS/MS)分析方法初步明确化结消瘤颗粒的化学成分及其入血成分;基于此，进一步探讨化结消瘤颗粒含药血清对结肠癌细胞的干预作用，为将化结消瘤颗粒开发为医院制剂奠定基础、为化结消瘤颗粒抗结肠癌作用的系统研究提供理论依据。 方法:1.采用传统工艺配制化结消瘤颗粒，并对其制备工艺及质量标准进行系统性研究，首先通过单因素考察、正交试验确立化结消瘤颗粒最佳的水煎煮提取工艺;以制粒的难易程度和颗粒收率为评价指标，对辅料种类、辅料用量、润湿剂的浓度等成型因素进行系统性研究;从而确定化结消瘤颗粒合理的制备工艺并进行中试放大试验，确保化结消瘤颗粒可过渡到批量生产。2.采用薄层色谱法等现代分析方法，对化结消瘤颗粒的性状、显微鉴别、薄层鉴别、浸出物、粒度、溶化性、以及重金属、砷盐、水分、微生物限度检查等项目进行系统性研究，制定化结消瘤颗粒的质量标准草案，可有效控制化结消瘤颗粒的质量。3.采用UPLC-QTOF-MS/MS联用分析方法对化结消瘤颗粒的化学成分及入血成分进行分析，初步探明化结消瘤颗粒主要的化学成分及入血成分。4.采用小鼠CT26.WT结肠癌细胞株进行插块传代的方法，建立结肠癌小鼠皮下移植瘤模型验证化结消瘤颗粒对结肠癌(Coloncancer,CC)的干预作用及PI3K/AKT信号通路的调控。将荷瘤小鼠随机分为6祖，分别为:模型组、阳性对照组(替吉奥胶囊，Tegafur,GimeracilandOteracilPotassiumCapsules,S-1)、化结消瘤颗粒低剂量组(36.92g/kg,HJFL)、化结消瘤颗粒高剂量组(73.84g/kg,HJFH)及化结消瘤颗粒低、高剂量联合替吉奥胶囊组(HJFL+S-1,HJFH+S-1),每组6只，另设一组空白对照组，观察各组小鼠给药过程中的生存状态、肿瘤生长趋势及各组药物的小鼠肿瘤抑制率;此后，利用苏木精-伊红(HE)染色，检查各组小鼠肿瘤组织的变化，使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中炎症因子的含量，包括白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6（IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),采用免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)考察化结消瘤颗粒对小鼠凋亡相关蛋白的调节作用，蛋白免疫印迹(WesternBlot,WB)实验考察化结消瘤颗粒对肿瘤组织中PI3K/AKT信号通路关键蛋白的调控作用，进一步阐明化结消瘤颗粒体内抗CC的作用机制。5.将HCT116人结肠癌细胞作为受试对象，采用CellCountingKit-8(CCK8)法、平板克隆实验、划痕实验和Hoechst33342染色实验，初步考察化结消瘤颗粒含药血清对HCT116人结肠癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。 结果:1.优选出化结消瘤颗粒的最佳制备工艺参数为:按处方量称取饮片，加水浸泡0.5小时后加水至12倍量，煎煮3次，每次1.5小时,收集滤液合并，沉降过夜;取上清液，减压浓缩(真空度:-0.05Mpa,80℃)至相对密度为1.30～1.40(60℃)的浸膏。将蜈蚣粉碎，烘干，取浸膏，按照浸膏量:糊精为1∶1的比例加入糊精，同时加入蜈蚣粉，将三者混匀,干燥，粉碎，喷洒70％乙醇过1号筛制软材，置于70℃烘箱中干燥，用1号筛与5号筛整粒，制备的颗粒均符合《中国药典》2020版四部制剂通则0104的各项检查。2.本研究建立了蜈蚣的显微鉴别法和黄芪、甘草2味饮片的薄层色谱鉴别法，并暂定浸出物含量不得少于29.0％,其他检查项目均符合《中国药典》2020版颗粒剂通则项下的要求。3.采用UPLC-QTOF-MS/MS技术，对化结消瘤颗粒的水溶液进行了初步表征，并通过与对照品和文献信息进行对比，共鉴别出20种化合物，入血成分10个。4.荷瘤小鼠实验中，与模型组对比，替吉奥胶囊组、化结消瘤颗粒高、低剂量组及联合替吉奥胶囊组小鼠的生存状况更佳，其中化结消瘤颗粒联合替吉奥胶囊的两组生存状况最优。对比模型组，各组小鼠对肿瘤生长有显著抑制作用，显著减少了小鼠肿瘤体积增长趋势和肿瘤瘤重(P＜0.01),抑制率从大到小排列为:化结消瘤颗粒高剂量组+替吉奥胶囊组＞化结消瘤颗粒低剂量组+替吉奥胶囊组＞替吉奥胶囊组＞化结消瘤颗粒高剂量组＞化结消瘤颗粒低剂量组。HE染色结果表明，模型组小鼠肿瘤组织中的细胞排列紧密，整体生长态势良好，其余各组小鼠的肿瘤组织中，肿瘤细胞细胞核结构出现不同程度的坏死、破裂，尚存的完整细胞排列疏松、肿胀。其中，化结消瘤颗粒与替吉奥胶囊联合用药组对肿瘤组织的的抑制效果最显著。ELISA检测结果表明:模型对照组荷瘤小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量与空白对照组比较明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。其余各组荷瘤小鼠血清含量都明显降低，与模型对照组比较差异具有显著性意义。在作用机制的初步研究中，IHC实验及WB实验的结果表明:化结消瘤颗粒高、低剂量组和替吉奥胶囊组以及联合给药组均可显著调控PI3K/AKT信号通路及凋亡相关蛋白的表达。5.CCK8法结果表明:化结消瘤颗粒含药血清在体外对HCT116细胞的抑制率存在显著的剂量与时间依赖性，在同一浓度下，随着作用时间的延长，对HCT116细胞的抑制率逐渐递增;在相同时间随着浓度由10％到20％递增，其对细胞增殖的抑制作用也逐渐增强。平板克隆试验结果表明，化结消瘤颗粒含药血清呈剂量依赖性地减少HCT116细胞克隆形成数目。Hoechst33342染色试验结果表明:化结消瘤颗粒含药血清在剂量依赖性促进HCT116细胞的凋亡。划痕试验结果表明:化结消瘤颗粒含药血清能抑制HCT116细胞的迁移。上述结果初步验证了化结消瘤颗粒含药血清可以抑制HCT116细胞的增殖、迁移并促进细胞凋亡。 结论:本实验优选的化结消瘤颗粒的制备工艺切实可行、科学合理,制定的质量标准可控，为化结消瘤颗粒的制剂开发研究提供了科学的实验依据。物质基础研究中，初步鉴定出化结消瘤颗粒的化学成分20个，入血成分10个。体内药效研究表明:化结消瘤颗粒能够抑制小鼠结肠癌的发展且对小鼠无明显毒副作用，与S-1联合用药药效有加性作用。作用机制的初步研究表明:化结消瘤颗粒含药血清在体外能抑制人结肠癌细胞HCT116细胞的增殖及迁移，并促进HCT116细胞的凋亡，呈现剂量依赖性。本研究基于血清药理学、血清药物化学等学科，从细胞和动物层面阐述了化结消瘤颗粒抗结肠癌的药效作用及作用机制。
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