摘要
目的:研究表明脑源性神经营养因子(BDNF)通过激活酪氨酸激酶受体B(TrkB)及其下游PI3K/Akt和MAPK等信号通路调节多种生物学过程。神经营养因子家族如BDNF半衰期短且很难穿过血脑屏障，因此临床应用受限。7,8-二羟基黄酮(7,8-DHF)是来源于植物的类黄酮化合物，可较好地模拟BDNF且可穿透血脑屏障，对帕金森等神经退行性疾病有很好的疗效。心血管疾病的发生发展与线粒体功能障碍密切相关。前期研究表明7,8-DHF可改善心脏功能，减轻病理刺激引起的线粒体损伤，然而7，8-DHF对心肌细胞线粒体的直接调节作用尚不完全清楚。鱼藤酮(Rot)作为农业中常用的杀虫剂，常作为线粒体呼吸电子传递链(ETC)复合物Ⅰ的抑制剂，阻断线粒体电子传递造成线粒体功能抑制。本研究旨在探讨7,8-DHF对Rot诱导的心肌细胞线粒体功能障碍的作用及其机制，为心肌保护药物开发提供新思路。 方法:本研究主要分为三个部分: 第一部分，建立Rot诱导的H9c2心肌细胞线粒体功能障碍模型，光镜观察Rot对心肌细胞损伤与存活的影响，并通过乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)试剂盒及LIVE/DEAD染色明确Rot诱导心肌细胞损伤模型的最佳浓度以及7,8-DHF改善Rot诱导心肌细胞损伤的有效浓度。采用JC-1和线粒体靶向超氧化物歧化酶模拟物(Mito-SOX)染色分别检测线粒体膜电位和活性氧(ROS)水平。采用高分辨率线粒体呼吸测定系统检测线粒体呼吸功能变化，观察线粒体呼吸耗氧率(OCR)变化以及基础呼吸水平(Routine)、最大线粒体呼吸(MMR)、储备呼吸能力(RRC)和漏呼吸(Leak)等变化情况。应用蛋白印迹技术检测线粒呼吸体复合体蛋白表达。分别测定ATP和丙酮酸激酶(PK)水平，评价H9c2心肌细胞能量代谢情况。 第二部分，建立Rot诱导的HL-1心肌细胞线粒体功能障碍模型，通过光镜观察、LDH水平测定及LIVE/DEAD染色检测7,8-DHF对不同浓度Rot处理的HL-1心肌细胞形态、LDH释放及死细胞比例的影响，验证7,8-DHF抑制Rot诱导心肌细胞损伤的保护作用。然后采用Mito-SOX探针检测心肌细胞线粒体ROS产生情况。检测HL-1心肌细胞线粒体呼吸OCR、Routine、MMR、RRC以及Leak等变化。采用蛋白印迹技术检测HL-1心肌细胞线粒体呼吸复合体蛋白表达。检测ATP水平，评价HL-1心肌细胞能量代谢变化。 第三部分，初步探讨7,8-DHF抑制Rot诱导心肌线粒体损伤的作用机制。分别利用抗氧化剂NAC和线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO,阐明7,8-DHF是否通过抗氧化机制发挥抑制Rot诱导心肌损伤的保护作用。进一步采用蛋白印迹技术检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK),信号转导及转录激活蛋白3(STAT3)磷酸化和核转位情况以及Akt、p38MAPK等的蛋白表达，探究7,8-DHF抑制Rot诱导心肌损伤保护作用的分子机制。 结果:7,8-DHF可有效抑制Rot诱导的心肌细胞损伤与死亡，并减少LDH释放。7,8-DHF显著改善Rot诱导的线粒体膜电位下降，抑制线粒体ROS水平。瞬时给予7,8-DHF可增加H9c2心肌细胞的Routine和Leak呼吸;7,8-DHF孵育24h逆转Rot诱导的H9c2心肌细胞线粒体Leak呼吸的增加，对Rot处理后心肌细胞线粒体MMR以及RRC无显著影响。7,8-DHF逆转Rot诱导心肌细胞线粒体呼吸复合体Ⅰ和Ⅳ蛋白表达增加。7,8-DHF进一步增加Rot诱导H9c2细胞ATP和PK水平。7,8-DHF在Rot诱导HL-1细胞模型中的作用与H9c2心肌细胞中基本一致。NAC或Mito-TEMPO抑制ROS的产生并不能改善Rot诱导的心肌细胞损伤。7,8-DHF抑制AMPK磷酸化，诱导心肌细胞p-STAT3-Y705核转位。此外，7,8-DHF干预还可激活Akt和p38MAPK信号。结论:7,8-DHF能够有效改善Rot诱导的心肌细胞损伤和线粒体功能障碍。7,8-DHF的保护作用可能与调节Akt、p38MAPK以及AMPK信号促进p-STAT3-Y705核转位有关。本研究首次发现7,8-DHF是防治心脏疾病时线粒体功能障碍的潜在化合物。
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