摘要
膀胱癌(Bladdercancer,BCa)是泌尿系统常见的恶性肿瘤，近年以来，膀胱癌的发病率和死亡率逐年升高。临床上尿路上皮癌占全部膀胱癌的90％以上，根据其浸润深度，膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌(Non-muscle-invasivebladdercancer,NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(Muscle-invasivebladdercancer,MIBC)。其中MIBC的5年生存率不足50％,转移性膀胱癌预后更差，5年生存率不足15％。由于膀胱癌异质性较大，不同分子亚型膀胱癌对化疗和靶向治疗反应差异较大，使得在过去数十年间膀胱癌的治疗方式未取得跨越式发展。近年来，以免疫检查点抑制剂(Immunecheckpointinhibitors,ICIs)为代表的免疫治疗的出现，使得膀胱癌的治疗格局得到彻底改变。但由于肿瘤免疫微环境的复杂性，部分膀胱癌患者接受ICIs治疗后疗效不佳。在此背景下，深入解析膀胱癌免疫治疗过程中免疫微环境的变化，探索未来潜在治疗靶点，研发新型联合免疫治疗方案，对于进一步提高膀胱癌免疫治疗疗效至关重要。 纤维蛋白原样蛋白1(Fibrinogen-likeprotein1,FGL1)是新型免疫检查点LAG3的主要功能性配体，FGL1定位于人类8号染色体(8p22-21.3)上，是一个由二硫键连接的同源二聚体的分泌型蛋白。FGL1通过与位于T细胞表面的LAG3结合，抑制T细胞活化与功能。已有研究表明FGL1-LAG3与肝细胞癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤的进展和预后有关。同时FGL1的表达水平与肺癌及黑色素瘤患者anti-PD-1/PD-L1的疗效有关。然而目前FGL1在膀胱癌免疫治疗中表达变化和作用尚不清楚。 N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)甲基化被认为是真核细胞中最普遍、最丰富和最保守的表观转录组修饰。m6A甲基化是由包括甲基转移酶、去甲基化酶和阅读蛋白等调控的动态可逆反应，参与多种生理和病理过程。大量的研究表明，m6A甲基化修饰在多种恶性肿瘤的发生、转移和耐药性等过程中具有关键调控作用。其中作为细胞内关键的去甲基化酶，ALKBH5已被证明通过m6A修饰方式调控多个基因表达，并在不同类型肿瘤中发挥抑癌或促癌功能。此外异常表达的ALKBH5可通过调节免疫检查点分子PD-L1表达影响肿瘤免疫微环境，并最终影响免疫治疗疗效，这表明ALKBH5参与肿瘤免疫调控。然而，尽管目前已有研究发现ALKBH5抑制膀胱癌细胞增殖和迁移，但尚无相关研究探索ALKBH5在膀胱癌免疫治疗中的作用，同时ALKBH5介导的m6A甲基化修饰是否参与调控新型免疫检查点FGL1表达尚不清楚。本课题在m6A去甲基化酶ALKBH5调控FGL1表达及其对膀胱癌免疫治疗的作用和作用机制进行研究，取得以下结果: 第一部分膀胱癌中FGL1表达水平对免疫微环境和免疫治疗疗效的影响 本部分研究目的:1.利用公共数据库，分析接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的膀胱癌患者，应答组与无应答组中多个免疫检查点相对表达水平，明确FGL1在应答组与无应答组中差异表达，研究膀胱癌中FGL1对PD-1/PD-L1抑制剂治疗疗效和预后的影响;2.检测PD-1/PD-L1抑制剂治疗前、治疗后的肿瘤组织和尿液中FGL1表达水平;3研究FGL1对肿瘤浸润T细胞和肿瘤免疫微环境的影响;4.明确FGL1对抗PD-1/PD-L1治疗介导的抗肿瘤效应的影响。具体结果如下: 1.FGL1表达水平在抗PD-1/PD-L1治疗无应答膀胱癌患者中表达水平升高。利用膀胱癌免疫治疗队列资料(IMvigor210)结合已公开发表的信息，分析免疫治疗应答与无应答患者中免疫检查点基因表达差异，结果显示与应答组相比，FGL1表达水平在无应答患者中升高。进一步利用GEO数据库数据(GSE176307)进行验证分析，结果同样表明，与完全缓解和部分缓解患者相比，疾病稳定和疾病进展的患者中FGL1表达水平显著上调。同时预后分析表明高表达FGL1的膀胱癌患者预后不佳。 2.膀胱癌抗PD-1/PD-L1治疗后FGL1表达水平升高。收集膀胱癌患者新辅助免疫治疗前、治疗后尿液和组织标本，发现与接受治疗前的尿液和肿瘤组织相比，治疗后患者尿液和肿瘤组织中FGL1表达水平升高。此外在小鼠膀胱癌模型中，给与PD-1抑制剂处理，结果同样表明，PD-1抑制剂作用后，小鼠肿瘤组织中FGL1转录和蛋白表达水平升高。 3.FGL1表达水平影响肿瘤浸润CD8+T细胞和抗PD-1治疗疗效。对数据库信息进行生物信息学分析，结果表明高表达FGL1的肿瘤组织中CD8+T细胞、M0型巨噬细胞等免疫细胞减少;通过对小鼠肿瘤组织进行流式细胞学分析，结果同样表明升高FGL1表达可显著减少肿瘤微环境中CD8+T细胞数目，而CD8+T细胞与膀胱癌免疫治疗疗效具有相关性;肿瘤细胞与CD8+T细胞共培养实验表明，高表达FGL1抑制CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤，下调FGL1表达后，CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力增强;进一步在小鼠模型中分析FGL1表达水平对抗PD-1治疗疗效的影响，结果表明高表达FGL1有效减弱PD-1抑制剂对肿瘤生长的抑制作用，FGL1抑制剂和PD-1抑制剂联合应用可在高表达FGL1膀胱癌中激发有效的抗肿瘤效应。 第二部分ALKBH5通过Lnc-XIST/miR-124-3p轴调控FGL1表达 鉴于已证明膀胱癌接受免疫治疗后FGL1表达水平升高并抑制免疫治疗疗效，为进一步探究FGL1表达升高的具体分子机制以及m6A甲基化修饰在FGL1表达调控中的作用。我们进行深入研究，并取得以下结果: 1.ALKBH5抑制FGL1的表达。我们利用siRNAs靶向下调m6A甲基化相关基因ALKBH5、FTO和METTL14表达，RT-qPCR实验检测下调上述基因表达后FGL1的mRNA表达水平，结果发现敲低ALKBH5表达后，FGL1mRNA表达水平升高，但FTO和METTL14并不影响FGL1的mRNA表达水平。Westernblot实验结果证明敲低ALKBH5表达后，FGL1蛋白表达水平升高。另一方面，升高ALKBH5表达后，FGL1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低，提示ALKBH5抑制FGL1的表达。肿瘤细胞与CD8+T细胞共培养实验表明，敲低ALKBH5后，CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用减弱，而下调FGL1表达后，可有效恢复CD8+T细胞的杀伤作用。这些结果表明ALKBH5通过调控FGL1表达影响CD8+T细胞的对肿瘤细胞的杀伤作用。 2.ALKBH5通过Lnc-XIST调控FGL1表达。鉴于m6A甲基化修饰是长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,Lnc-RNA)最普遍的转录后修饰，以及特定位点的m6A甲基化对于Lnc-XIST发挥其功能至关重要。本研究首先通过RT-qPCR实验验证膀胱癌中ALKBH5抑制Lnc-XIST的表达，并进一步利用Me-RIP-RT-qPCR实验证明ALKBH5通过m6A甲基化途径调控Lnc-XIST表达。此外，下调Lnc-XIST表达可显著降低FGL1的表达和分泌。拯救实验证实ALKBH5调控FGL1表达依赖Lnc-XIST。 3.Lnc-XIST通过miR-124-3p调控FGL1表达。利用在线数据库预测调控FGL1表达的潜在miRNAs,通过转染miRNAmimics后检测FGL1表达水平，鉴定具有调控FGL1表达作用的miRNAs,结果显示只有转染miR-124-3pmimics后FGL1mRNA和蛋白表达水平显著降低。而转染miR-124-3pinhibitor后，FGL1mRNA和蛋白表达水平明显升高。双荧光素酶报告实验结果证实miR-124-3p通过与FGL13''UTR区结合，调控其蛋白表达。为进一步明确Lnc-XIST通过miR-124-3p调控FGL1,首先通过RT-qPCR实验证实敲低Lnc-XIST后miR-124-3p表达水平升高，提示Lnc-XIST调控miR-124-3p表达。双荧光素酶报告实验与Ago2-RIP-RT-qPCR实验证实Lnc-XIST与miR-124-3p相互结合，后续拯救实验表明Lnc-XIST通过miR-124-3p调控FGL1表达。 4.ALKBH5通过Lnc-XIST/miR-124-3p轴调控FGL1,在明确ALKBH5通过Lnc-XIST调控FGL1表达，以及Lnc-XIST通过miR-124-3p调控FGL1表达的基础上，通过多项拯救实验明确ALKBH5通过Lnc-XIST/miR-124-3p轴调控FGL1表达。 在明确膀胱癌抗PD-1治疗后FGL1表达水平升高，并且高表达FGL1影响抗PD-1治疗效果，后续研究证实下调ALKBH5显著促进FGL1表达，故而我们猜想在ALKBH5低表达膀胱癌中抗PD-1治疗效果受到显著抑制。为此，我们进行深入研究，并得到以下结果: 1.ALKBH5影响肿瘤浸润免疫细胞。利用公开发表的数据库信息分析不同ALKBH5表达水平膀胱组织中肿瘤浸润免疫细胞差异，发现低表达ALKBH5肿瘤组织中CD8+T细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞和树突状细胞比例显著下调，然后利用小鼠模型，验证低表达ALKBH5有效抑制肿瘤浸润CD8+T细胞。 2.双重阻断FGL1/LAG3和PD-L1/PD-1通路显著抑制ALKBH5低表达膀胱癌生长。在小鼠模型中分析ALKBH5表达水平对PD-1抑制剂治疗疗效的影响，结果表明低表达ALKBH5肿瘤中PD-1单抗或FGL1单抗对肿瘤生长的抑制作用显著减弱，联合阻断FGL1和PD-1在低表达ALKBH5膀胱癌中产生更为显著的抗肿瘤效应。以上结果表明双重阻断FGL1和PD-1的联合治疗策略在低表达ALKBH5的膀胱癌中更为有效。 结论 1.膀胱癌免疫治疗诱导FGL1表达升高，影响抗PD-1治疗疗效。高表达FGL1具有免疫抑制作用，抑制肿瘤浸润CD8+T细胞和抗PD-1治疗疗效。 2.ALKBH5通过Lnc-XIST/miR-124-3p轴调控FGL1表达。 3.ALKBH5低表达膀胱癌中肿瘤浸润免疫细胞少、单一PD-1抑制剂治疗效果差。双重阻断PD-1和FGL1可有效抑制ALKBH5低表达膀胱癌的生长。
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