摘要
研究背景与目的： 外泌体（Exosomes，Exo）是细胞膜向外释放的杯状脂双层膜小泡（直径30-150nm），广泛存在于各种体液及细胞培养液中。因此，从血液中检测到不同癌细胞的外泌体对肿瘤的筛查、诊断及治疗有着重要作用。目前，外泌体的检测主要基于外泌体特异性蛋白及免疫亲和原理，抗原抗体相互作用特异性强，但是，抗体制造成本较高，且对储藏要求高，仍需寻找准确度高、可靠、可用于临床应用的抗体替代品。 适配体（Aptamer）是经体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术（SystematicEvolutionofLigandsbyEXponentialEnrichment，SELEX）筛选获得的寡核苷酸单链，尺寸较小为30-100bp（6-26kDa）。近年来，由于适配体易合成、易储存，低成本及高稳定性的特性且可被多种分子（如荧光染料、酶）进行标记，已被广泛应用于生物传感器领域，用来检测小分子物质、细胞以及外泌体。随着适配体研究的发展，适配体筛选方法逐渐成熟，尤其结合新型纳米材料发展的筛选技术不仅大大缩短了筛选周期，还提高了适配体的特异性。 氧化石墨烯（Grapheneoxide，GO）具有极强的距离依赖性荧光淬灭能力，可以通过π-π电子堆积相互作用与单链DNA、RNA连接。GO具有很高的筛选效率，能够简单而清晰地区分未结合的和与目标结合的ssDNA。 为实现可视化的基于GO的外泌体的适配体筛选程序，本研究通过GO-SELEX筛选方法，以非小细胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）A549细胞外泌体为靶标，筛选获得能特异识别外泌体的适配体，分析其特异性和亲和力并阐明新型DNA适配体的空间结构。为构建新型的生物传感器提供理论依据，为肺癌液体活检和早期诊断提供技术支撑。 材料与方法： （1）NSCLCA549细胞外泌体的分离提取及鉴定 本实验中，采用本实验室非小细胞肺癌细胞A549作为制备外泌体的来源。以人乳腺癌细胞MCF-7的外泌体作为负筛选的靶标，制备两种细胞系的外泌体。细胞培养方法严格按照ATCC操作指南，当细胞生长到约50%的覆盖率时，吸去上清液，用1×PBS冲洗两次，加入无血清的培养基培养48h，然后收集细胞上清液，分别采用超速离心法以及结合超速离心法（Ultracentrifugation，Ult）与试剂盒（ExoQuickTM）的方法（U-EQ）从细胞培养上清液中分离外泌体。通过BCA测定A549细胞外泌体的浓度，利用透射电镜（Transmissionelectronmicroscope,TEM）、纳米粒子追踪分析（Nanoparticletrackinganalysis,NTA）和DiI染色观察A549细胞外泌体的形态及粒径大小，使用蛋白免疫印迹（Westernblotting,WB）分析A549细胞外泌体表面四次跨膜蛋白CD63和热休克蛋白70（HeatShockProtein70，HSP70）的表达。 （2）基于GO-SELEX的NSCLCA549细胞外泌体的适配体的筛选及鉴定 通过建立氧化石墨烯-富集配体系统进化技术（GO-SELEX）针对靶标A549细胞外泌体进行适配体筛选。首先进行正筛选；将准备好的筛选文库ssDNA首先固定于GO表面，摇床上孵育，孵育一定时间后离心得沉淀GO/ssDNA复合物，然后GO/ssDNA复合物与分离提纯的A549细胞外泌体在4℃条件下共同孵育，孵育一定时间，通过GO的π-π共轭键吸附未结合靶标外泌体的ssDNA，已结合靶标的ssDNA（外泌体/ssDNA）则留在上清液中，通过离心获得上清中的A549细胞外泌体/ssDNA复合物。前3轮采用相同的时间孵育，从第4轮开始逐渐减短孵育时间。 负筛选：第5轮和第9轮为反筛选，将负筛选的外泌体，即乳腺癌细胞MCF-7的外泌体作为负筛选的靶标。将准备好的ssDNA文库先加入GO溶液中，摇床上孵育，孵育一定时间后离心得沉淀GO/ssDNA复合物，然后GO/ssDNA复合物与分离提纯的MCF-7细胞外泌体在4℃条件下共同孵育（孵育时间随筛选轮数增加而递增），孵育一定时间后用离心弃去上清中的MCF-7细胞外泌体/ssDNA复合物，在沉淀GO/ssDNA复合物加入分离提纯的A549细胞外泌体在4℃条件下共同孵育，孵育一定时间后用离心获得上清中的A549细胞外泌体/ssDNA复合物。 将每一轮筛选的外泌体/ssDNA复合物经离心回收所得到的ssDNA作为模板进行不对称PCR扩增，通过热变性（95℃，5min）将PCR产物的双链DNA（dsDNA）彻底裂解为单链ssDNA，作为次级ssDNA文库进入下一轮筛选。每一轮的筛选计算一次回收率，在第5轮及第9轮，引入反筛选物乳腺癌MCF-7细胞外泌体，以去除与A549细胞外泌体特异性结合较差的ssDNA。当回收率达到饱和，筛选停止。本研究共进行了12轮核酸适配体的筛选。 经过多轮筛选结合的文库达到饱和后，对筛选文库用不带标记的引物进行对称PCR扩增，扩增后的产物用于TA克隆和测序，TA克隆过程由TaKaRa试剂盒完成，测序过程由上海生工生物工程公司完成。测得的序列，用软件BioEdit进行统计分析和绘制进化树，用Mfold（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/dna-folding-form）进行二级结构的分析。最后评价筛选所得适配体的特异性和亲和力。 结果： 1.本研究应用结合超速离心法与试剂盒的U-EQ法以及超速离心法分别分离、提取外泌体，并通过BCA蛋白测定试剂盒、NTA、TEM、细胞膜橙红色荧光探针染色（DiI）以及WB鉴定A549细胞外泌体浓度、数量、形态及蛋白表达；数据显示，U-EQ法分离提取的外泌体产量较超速离心法高，酶标仪结果显示（A280）浓度达1.355mg/mL，NTA结果颗粒数达4.65×109颗粒/mL，峰值尺寸分布范围为81.5～165.5nm，DiI及TEM显示形态大小均一纳米级囊泡，应用WB验证分离提取的外泌体存在其表达的CD63及HSP70蛋白。 2.PCR结果显示，经12轮筛选均得到了所需要的目的ssDNA片段。对第11轮的筛选产物克隆并测序，共得到43条核酸适配体序列。经对43条核苷酸序列的二级结构、自由能（△G）预测和亲缘性分析，最终得到Exo-1、Exo-2、Exo-11、Exo-17、Exo-20、Exo-34共6条核酸适配体。利用相同数量的肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7、胰腺癌细胞PANC-1、乳腺癌细胞4T1、人结肠癌细胞HCT116、人结肠癌细胞HT29细胞外泌体对6条适配体进行特异性分析试验，结果表明Exo-2、Exo-11、Exo-203条适配体均可以与A549细胞外泌体特异性结合，且适配体Exo11与A549细胞外泌体的特异性结合作用更强；通过测定3条特异性较强适配体的解离常数（Dissociationconstant,Kd）分析其与A549细胞外泌体的亲和性。结果显示，3条适配体Exo-2、Exo-11、Exo-20的Kd值分别为在56.15nM、55.92nM、73.25nM；且适配体Exo-11与A549细胞外泌体的亲和力作用更强，可作为A549细胞外泌体的特异性核酸适配体。 结论： 1.在本研究中，结合超速离心法与试剂盒分离提取外泌体的U-EQ法，用于从细胞培养上清液中分离和纯化外泌体。成功地从A549的细胞培养上清液中分离出外泌体，并对其进行了分析鉴定。通过TEM、NTA、荧光染色和WesternBlot鉴定了外泌体的形状、颗粒大小和蛋白表达。数据表明，U-EQ法分离提取的外泌体浓度高、粒径均一，高质量的外泌体提取有望得到进一步研究。 2.通过使用GO-SELEX方法，筛选A549外泌体特异性适配体。共筛选了12轮，本研究筛选出6条重复率较高的适配体。对于肺癌A549细胞外泌体，所得到的适配体Exo-11的特异性较高且Kd值较低，为55.92nM，表明适配体Exo-11是靶标A549细胞外泌体的特异性适配体。
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