摘要
阿尔茨海默病(Alzheimer''sdisease,AD)是威胁老年人健康和生命的神经系统疾病之一，其发病机制复杂多样。越来越多的证据表明，神经元Ca2+稳态失调可能是AD发病的早期事件，Ca2+异常升高可促进Aβ斑块和神经纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFTs)的形成。蝙蝠葛碱(Dauricine,DAU)是一种Ca2+抑制剂，提取自北豆根(MenispermumdauricumDC)的干燥根茎。有研究初步表明，DAU可能具有防治AD的潜在作用。然而，其在体内能否通过调节脑内Ca2+水平及相关信号通路而发挥抗AD作用尚不清楚。因此，本研究首次基于Ca2+/CaM信号通路及其下游分子(CaMKⅡ、BACE1等)考察蝙蝠葛碱治疗AD小鼠的作用及机制。 首先，通过连续90天腹腔注射D-半乳糖(D-gal,150mg/kg)并灌胃给予AlCl3(20mg/kg)建立AD小鼠模型。从开始造模的第61天开始，连续30天腹腔注射给予小鼠DAU(1mg/kg和10mg/kg)进行治疗。通过筑巢实验、新物体识别实验和Morris水迷宫实验对AD小鼠的学习记忆以及认知功能进行行为学评估。结果表明，DAU治疗显著增强了AD小鼠的短期识别记忆能力和长期空间学习和记忆能力，改善了AD小鼠的个体筑巢和集体筑巢能力。此外，给予DAU(10mg/kg)治疗可显著增高AD小鼠的体重，并显著缓解D-gal和AlCl3对小鼠脑、肝脏、脾脏和肾脏造成的损伤。对小鼠脑组织石蜡切片进行HE染色发现，DAU可抑制AD小鼠大脑海马和皮质组织病理学改变，减轻神经元损伤。 接下来，对脑组织切片进行刚果红染色，发现给予DAU(1mg/kg和10mg/kg)治疗后，AD小鼠大脑海马的CA3和DG区域及皮质中淀粉样斑块沉积明显减少。通过WesternBlot法检测相关蛋白质表达水平，发现DAU治疗抑制了AD小鼠海马和皮质中APP和BACE1蛋白表达的异常升高，并抑制了Aβ1-42蛋白的产生。通过分子对接技术发现DAU与APP和BACE1可能具有较好的结合能力。 下一步，对脑组织切片进行甘氨酸银浸染色，发现给予DAU(1mg/kg和10mg/kg)治疗后，AD小鼠海马及皮质中NFTs的产生明显减少。WesternBlot检测的结果表明，DAU治疗显著降低了AD小鼠海马和皮质中Tau和CaMKⅡ的磷酸化水平，并抑制了CaM的表达。通过邻甲酚酞络合酮法检测发现DAU治疗显著降低了AD小鼠海马和皮质中Ca2+水平。通过分子对接技术研究发现DAU与CaM和CaMKⅡ可能具有较好的结合能力。 综上，DAU可以显著改善D-gal和AlCl3联合诱导的AD小鼠的认知功能障碍。在AD小鼠脑内，DAU通过抑制APP和BACE1的表达，抑制了APP淀粉样水解途径及Aβ1-42蛋白的产生，从而有效地减少淀粉样斑块沉积;同时，DAU通过抑制CaMKⅡ磷酸化水平，抑制了Tau蛋白过度磷酸化，从而有效缓解了NFTs病理的发展。DAU对AD小鼠的上述治疗作用可能与其对Ca2+/CaM信号通路的抑制密切相关。DAU可能从抑制Ca2+稳态失调、Tau蛋白磷酸化和淀粉样斑块形成方面发挥抗AD作用，具有进一步研究的价值。
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