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摘要
随着欧盟“限塑令”和我国“碳达峰、碳中和”的提出，生物基产品取代石油基产品已经成为当今研究领域的一个热门话题。以生物质资源为原料可以合成多种生物基平台化合物，其中2,5-呋喃二甲酸(FDCA)可以替代石油基来源的对苯二甲酸合成多种聚酰胺、聚酯和聚氨酯等多种高分子材料，具有巨大的应用潜力。目前，FDCA主要由生物质来源的5-羟甲基糠醛(HMF)为原料进行合成，合成方法主要有化学催化、酶催化和全细胞催化法。全细胞催化反应条件温和、不需要额外添加辅因子、可以将多步催化反应整合在同一个细胞内，因此受到越来越多研究者的关注。但是，目前可以全细胞催化HMF合成FDCA的菌株较少，并且对毒性HMF底物的耐受能力普遍较差，且多数菌株为条件致病菌，从而限制了FDCA的全细胞催化合成。因此，筛选对HMF耐受性较高的安全菌株对于实现FDCA的高效制备具有重要意义。本研究首先通过筛选获得了一株对HMF具有较高耐受性的菌株，然后对其FDCA合成条件进行了研究，最后通过对FDCA合成途径的强化显著提高了FDCA的合成效率。本文主要研究结果如下： (1)FDCA生产菌株的筛选及催化条件研究。通过筛选从造纸废水中获得一株具有催化HMF合成FDCA的菌株，通过分子生物学鉴定将其命名为解淀粉芽孢杆菌(BacillusamyloliquefaciensWTF1)。随后，对B.amyloliquefaciensWTF1的HMF耐受性和FDCA生产能力进行了研究。结果表明，当HMF浓度高于40mM时，细胞生长会受到严重抑制，FDCA产量仅为0.78mM。为了提高FDCA产量，采用全细胞催化法进行FDCA的合成。通过对全细胞催化条件的优化，最佳反应条件为细胞浓度OD600=100，HMF浓度75mM，温度30℃，pH7.0。在此最佳催化条件下，FDCA的产量为32.5mM，转化率为43%，转化率较低的原因主要为中间产物5-羟甲基-2-呋喃甲酸(HMFCA)的大量积累。 (2)HMFCA氧化酶催化特性的研究。为了促进中间产物HMFCA向FDCA的进一步转化，提高FDCA的合成效率，选择了三种可能催化HMFCA的酶(HmfH、ADH和MaAAO)进行研究。通过载体pET28a在大肠杆菌BL21(DE3)中，对HmfH、ADH和MaAAO进行异源表达纯化并对其催化条件进行研究。结果表明，HmfH的最适温度为30℃，最适pH为7.0；ADH的最适温度为30℃，最适pH为8.0；MaAAO的最适温度为25℃，最适pH为6.0。随后对酶的催化性能进行研究，三种酶均可催化HMFCA生成5-甲酰基-2-呋喃甲酸(FFCA)，然后进一步氧化生成FDCA，但HmfH的催化能力优于ADH和MaAAO。 (3)为了进一步提高B.amyloliquefaciensWTF1菌株的FDCA生产能力，首先尝试了在B.amyloliquefaciensWTF1菌株中利用质粒pSTOP分别单独表达HmfH、ADH、MaAAO，采用单独表达HmfH、ADH、MaAAO酶的重组B.amyloliquefaciensWTF1菌株并进行全细胞催化，在细胞浓度OD600为100，HMF浓度为75mM，温度为30℃，pH为7.0条件下，FDCA产量分别为48.2mM、37.1mM和37.8mM；为了进一步提高FDCA产量，分别在B.amyloliquefaciensWTF1菌株中共表达了HmfH和ADH以及HmfH和MaAAO，FDCA产量达到54.9mM和52.6mM。随后，在B.amyloliquefaciensWTF1菌株中共表达了HmfH、ADH和MaAAO，FDCA产量进一步提高至68.1mM，转化率为90.8%。
关键词
2,5-呋喃二甲酸/5-羟甲基糠醛/解淀粉芽孢杆菌/全细胞催化引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
生物与医药导师
王腾飞学位年度
2023学位授予单位
齐鲁工业大学语种
中文中图分类号
TQ