摘要
铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）属于兰科石斛属，为一种附生草本植物，是我国的名贵药材且药用历史悠久，在药品、食品、化妆品等领域已被广泛应用，市场价值较高。铁皮石斛具有自交不亲和性（self-incompatibility，SI），且自花授粉困难，自然繁殖率极低，不利于优良种质资源的保护。本研究对自交及异交授粉后的铁皮石斛样品进行细胞学观察，并检测铁皮石斛合蕊柱的核糖核酸酶活性，为铁皮石斛自交不亲和类型的判断提供依据；对铁皮石斛S-RNase基因进行鉴定，进一步证明铁皮石斛中含有S-RNase；并对自交及异交授粉的合蕊柱脂质组成分进行定性和定量分析，探究脂质表达与铁皮石斛自交不亲和的关系。主要研究结果如下： 1.铁皮石斛的细胞学观察与核糖核酸酶活性检测 通过制作切片对铁皮石斛自交授粉与异交授粉2h，4h，8h，12h，24h，36h，48h和72h后的花粉管生长以及子房发育的状况进行显微观察。结果显示自交授粉8h后，少量进入子房的花粉管停止生长，12h后花粉管显著减少；异交授粉4h后有大量花粉管进入子房并继续向下生长，24h后已见子房开始膨大。利用磷酸缓冲液提取铁皮石斛合蕊柱和叶片中的核糖核酸酶，以酵母RNA的酶解而引起吸光度增大来检测核糖核酸酶的活性，通过测定A260的值进行计算。结果显示铁皮石斛合蕊柱中核糖核酸酶的活性显著高于叶片中的活性。 2.铁皮石斛S-RNase基因鉴定 将铁皮石斛转录组T2家族基因置于NCBI数据库中进行比对，寻找到4个可以比对出S-RNase基因的T2家族基因：Dendrobium_GLEAN_10033446、Dendrobium_GLEAN_10081677、Dendrobium_GLEAN_10014997与Dendrobium_GLEAN_10014995。其中基因Dendrobium_GLEAN_10081677、Dendrobium_GLEAN_10014997、Dendrobium_GLEAN_10014995均比对出菜豆（Phaseolusvulgaris）中编码S-likeRNase的基因KF033466.1，4个基因间的相似性为72.30%。对4个T2家族基因进行系统发育树分析，发现Dendrobium_GLEAN_10033446与大麦（Hordeumvulgare）中编码S-likeRNase蛋白前体的基因AF182197.1以及玉米（Zeamays）中编码S-likeRNase的基因U66241.1之间的亲缘关系最近。将4个T2家族基因的氨基酸序列进行比对，发现有8段高度重复序列。对4个T2家族基因进行相对表达量分析，其中Dendrobium_GLEAN_10033446的自交相对表达量（2513.517）是异交相对表达量（1889.179）的1.33倍，Dendrobium_GLEAN_10014995的自交相对表达量（441.1434）是异交相对表达量（300.1807）的1.47倍。根据4个T2家族基因设计了14对特异性引物，经过筛选得到引物：F6/R6。用引物F6/R6对6份铁皮石斛DNA样品进行PCR扩增，产物经回收纯化后进行测序，得到6段非重叠峰序列（d1、d2、d3、d4、d5、d6）。将6段序列置于NCBI数据库中进行比对，发现d1、d2、d3、d4均有140bp左右的序列（Sd1、Sd2、Sd3、Sd4）与基因AF182197.1具有相似性，其中Sd1、Sd3、Sd4与基因AF182197.1之间的相似性达87.15%，Sd2与基因AF182197.1的相似性为70.68%。d6有65bp的序列（Sd6）与基因U66241.1相似度达83.08%。 3.铁皮石斛自交与异交脂质组的分离鉴定与分析 利用高效液相色谱串联质谱法，在铁皮石斛自交授粉（SF）与异交授粉（HF）的合蕊柱样品中共检测到863种脂质，包括30种类型；对SF、HF组的合蕊柱样品中含量排名前20的脂质进行分析，发现种类和数量均差别不大，其中含量最高的两种脂质都为亚油酸和甘油二酯。对SF、HF组的差异脂质进行筛选，共筛选出17个含量差异脂质，与SF组相比，HF组中有6种脂质含量上调，11种脂质含量下调，其中下调数量最多和下调倍数最大的为神经酰胺，表明铁皮石斛自交不亲和性与神经酰胺的表达密切相关。利用脂质组差异代谢物进行KEGG通路富集分析，SF组和HF组的差异脂质中有3个代谢物被注释到7条代谢通路中，发生极显著改变的代谢通路是磷酸肌醇代谢，其次是磷脂酰肌醇信号系统。
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