摘要
背景 胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤,是全球癌症相关死亡的第三大原因和我国癌症死亡的第六大原因.胰腺癌具有发病隐匿、侵袭性强、预后差、死亡率高等特点.胰腺癌发病机制复杂,目前缺乏特异性的诊断标志物和治疗靶点.EFNB1作为一种跨膜蛋白,是ephrin配体家族的成员之一.Ephrin配体与其Eph受体(Erythropoietinproduceshepatocytereceptors)相互作用并触发双向信号传导,在不同环境下发挥着促癌和抑癌的双重作用.已有不少研究表明,EFNB1广泛地表达于不同的肿瘤组织和细胞中,其表达的失调与肿瘤的发生发展和预后密切相关,已被证实有望成为新型生物标志物,然而EFNB1在胰腺癌中的表达及作用尚不清楚. 目的 本研究基于生物信息学分析EFNB1在胰腺癌中的表达及意义,以期为胰腺癌的诊断和治疗提供一定的理论基础. 方法 我们首先基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库和基因型组织表达(GTEx)数据库分析EFNB1在泛癌和胰腺癌中的mRNA表达水平;使用R语言分析EFNB1与胰腺癌患者临床病理特征及预后的相关性,分析其在胰腺癌中的诊断价值;利用R语言和STRING在线分析数据库筛选出EFNB1共表达基因,构建相关基因的蛋白质互作网络(Protein-ProteinInteractionNetworks,PPI),并筛选出枢纽基因,使用GO和KEGG分析推测EFNB1相关枢纽基因的功能及作用通路;利用TISIDB数据库和R包GSVA研究EFNB1表达与胰腺癌免疫浸润的关系.采用qRT-PCR及Westernblot检测EFNB1的mRNA和蛋白在PANC-1、PaTu-8988、MiaPaCa-2及BxPC-3四种胰腺癌细胞系的表达水平.在高表达EFNB1的胰腺癌细胞PANC-1和PaTu-8988中,通过小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)技术转染靶向EFNB1的siRNA-NC、siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3,并利用qRT-PCR及Westernblot筛选出干扰效果最明显的siRNA序列.利用CCK-8和细胞划痕实验检测下调EFNB1表达后胰腺癌细胞PANC-1和PaTu-8988的增殖和迁移能力的变化. 结果 1.生物信息学分析结果:在胰腺癌组织中,EFNB1的表达水平明显高于癌旁组织.EFNB1表达水平与胰腺癌患者慢性胰腺炎病史、组织学分级、残余肿瘤率和总生存期等临床病理特征显著相关(plt;0.05);而与性别、年龄、吸烟史、饮酒史和TNM分期、病理分期等无明显关系(pgt;0.05).Kaplan-Meier(KM,生存曲线)分析显示:EFNB1高表达与胰腺癌总生存期(OS)(HR=2.07,p=0.001)、无疾病进展期(PFI)(HR=1.58,p=0.023)和疾病特异性生存期(DSS)较差有关(HR=1.86,p=0.011).单因素Cox分析表明高表达的EFNB1与胰腺癌患者预后不良有关(plt;0.05).ROC(ReceiverOperatingCharacteristicCurve,受试者工作特征)曲线显示,EFNB1表达可区分胰腺癌组织与正常组织,其曲线下面积(AreaUnderCurve,AUC)为0.97(95%CI:0.968-0.994).列线图预测的1年、3年生存率与实际生存率基本一致.构建PPI网络,筛选出9个关键枢纽基因.GO功能富集分析显示:生物过程(biologicalprocesses,BP)显著富集于ephrin受体信号通路、轴突发展、激酶活性的正调控、轴突生成和蛋白质磷酸化;细胞成分(cellularcomponents,CC)富集于细胞表面与基材连接、粘着斑、膜锚固构件、肌动蛋白丝和细胞膜皱褶;分子功能(molecularfunction,MF)明显富集于酪氨酸蛋白激酶活性、跨膜受体酪氨酸蛋白激酶活性、ephrin受体结合、ephrin受体活性和跨膜ephrin受体活性.KEGG富集分析提示EFNB1富集于轴突导向、MAPK信号通路、RAS信号通路、Rap1信号通路、C型凝集素受体通路、ErbB信号通路和幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号转导.EFNB1表达与CD56bright自然杀伤细胞和Th2细胞的免疫浸润水平呈显著正相关(plt;0.05);相比之下,EFNB1表达与TFH细胞、pDC细胞、肥大细胞、细胞毒性细胞、B淋巴细胞、Tgd细胞、T细胞、T辅助细胞、中央记忆型T细胞、iDC细胞、自然杀伤细胞、CD8T细胞的浸润水平呈负相关(plt;0.05). 2.细胞分子生物学实验结果:EFNB1在胰腺癌细胞系中呈差异性表达,其表达水平从高到低依次为:PANC-1、PaTu-8988、MiaPaCa-2、BxPC-3.转染siRNA后成功地下调了Panc-1和PaTu-8988胰腺癌细胞中EFNB1的mRNA和蛋白表达水平,其中siRNA-3序列干扰效果最明显.下调EFNB1表达水平后,胰腺癌细胞的增殖和迁移能力明显受到抑制(plt;0.05). 结论 EFNB1在胰腺癌中表达水平高于正常组织,并且具有很高的诊断和预后价值.EFNB1可能通过介导轴突导向和MAPK信号通路调控胰腺癌的发生与发展,并且还可能参与胰腺癌的免疫调节.此外,EFNB1可能促进胰腺癌细胞的增殖和迁移.总之,EFNB1作为一个促癌基因,有望成为胰腺癌潜在的生物标志物和治疗靶点.
NETL