摘要
环亮氨酸（Cycloleucine，CL）抑制蛋氨酸腺苷转移酶（Methionineadenosinetransferase，MAT）催化蛋氨酸生成S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl-L-methionine，SAM），是常用的甲基供体抑制剂。SAM可以通过转甲基，转硫基氨和转丙基作用参与核酸和组蛋白的甲基化等修饰，从而影响生物的氧化应激，增殖和凋亡等过程。环亮氨酸通过降低RNA甲基化和组蛋白乙酰化水平来影响猪卵母细胞成熟和孤雌胚胎发育，但对猪雄性生殖的影响及作用机制尚不清楚。支持细胞是睾丸中与生殖细胞发育和精子发生密切相关的两种重要体细胞之一。因此，本研究以猪睾丸未成熟支持细胞系（immatureSertolicells，iSCs）为实验对象，解析CL对猪iSCs的生物学效应和分子机制。主要实验结果如下： （1）CCK8结果显示CL处理呈剂量（20mM、40mM和80mM）和时间（12h、24h、36h和48h）依赖模式显著降低猪iSCs活力。综合评价CCK8结果和后续实验对细胞的需要量，选取40mMCL处理36h继续后面的实验。40mMCL处理36h显著促进猪iSCs凋亡（16%vs.5%，P＜0.001），升高细胞内氧化应激活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）水平（1.55vs.1.00，P＜0.001）、降低线粒体膜电位（0.71vs.1.00，P＜0.001）和线粒体数量（0.74vs.1.00，P＜0.001）。免疫荧光染色显示CL（40mM，36h）处理著降低猪iSCs的RNAm6A、H3K4me3、H3K27ac和H4K16ac的修饰水平，升高H3K9me2水平，不改变H3K27me3和H3K9me3水平。ELISA检测表明CL（40mM，36h）处理对iSCs细胞的抗缪勒管激素（AMH）和雌二醇（E2）没有影响，但会降低其乳酸水平（2.62vs.4.18，P＜0.01）。综上，CL处理猪iSCs细胞有抑制其增殖，提高ROS水平，降低线粒体功能，改变表观修饰，从而促进凋亡的生物学效应。 （2）转录组测序鉴定了CL（40mM，36h）诱导猪iSCs1212个（536个上调和676个下调）基因表达显著差异（DEGs；|log2（foldchange）|≥1；Padj.＜0.05）。差异基因富集到DNA复制、有机酸代谢过程、细胞群体增殖的正调控、肌动蛋白丝束组装、脂质定位调控、Notch信号通路的调控、与分子氧结合或还原的氧化还原酶活性（作用于配对供体）、蛋白激酶A结合、生长因子结合等重要的GO生物学过程，涉及的主要差异基因有Aco1、Akap1、C3、Dio1、Enho、F3、Fgfr2、Fen1、Fmo2、Itgav、Igfbp5、Lpcat3、Met、Mcm2、Mcm3、Nrp1、Nrarp、P4ha1、Sox9、Scd、Spp1、Tfrc、Tcim、Wasf2和Wasf2等。差异基因富集到DNA复制、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路、细胞周期、HIF-1信号通路、Wnt信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控、糖酵解和糖异生等KEGG通路，涉及的差异基因包括Actg1、Acss、Cd、Cdkn1a、Fads2、Fzd1、Hk2、Hmgcs1、Itga1、Itgav、Mcm4、Mcm7、Mmp7、Spp1、Rpa3、Tfrc和Tle2等。这些结果表明，CL（40mM，36h）处理会重编程猪iSCs转录组，改变多种重要的信号通路。 （3）选择脂质/激素代谢、生殖发育、氧化应激和凋亡通路中差异程度较大的8个DEGs（Adm、Birc5、C3、Dusp1、Hk2、Hmgcs1、P4ha1和Scd）进行RT-qPCR验证，结果表明8个mRNAs均与RNA-seq变化趋势一致。Westernblot进一步验证表明，CL(40mM，36h)处理猪iSCs诱导HMGCS1和P4HA1蛋白水平显著降低，变化趋势和mRNA一致。RT-qPCR验证核酸和组蛋白甲基化相关的7个DEGs（Dnmt1、Ezh2、Igfbp5、Mat2a、Setd2、Tfrc和Ythdf2），Dnmt1、Ezh2、Igfbp5和Tfrc与测序结果变化趋势一致，Mat2a、Setd2和Ythdf2没有显著变化。IGFBP5蛋白水平在CL组显著升高，变化趋势与转录组测序和RT-qPCR检测一致。因此，不同实验方法在不同的基因表达水平上验证了CL诱导猪iSCs差异表达的部分基因。 综上，CL处理猪iSCs呈剂量和时间依赖模式显著降低细胞活力。CL（40mM，36h）处理猪iSCs提高细胞的ROS水平，降低线粒体功能，促进凋亡，改变表观修饰，重编程转录组，影响多种重要的信号通路。本研究结果为进一步解析通过改变甲基化表观修饰信号通路而调控动物雄性生殖提供参考。
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