摘要
微管微丝交联因子1（Microtubuleactincrosslinkerfactor1,MACF1）是一个巨大的细胞骨架蛋白。在哺乳动物细胞中，MACF1对于稳定微管、微丝细胞骨架动力学，维持细胞形态等功能具有重要意义。MACF1也参与黏着斑动力学调控。另外，作为哺乳动物重要的细胞结构蛋白，MACF1也在调控细胞增殖、迁移、分化等途径中发挥重要作用。本课题组前期研究发现，在体外条件下，MACF1对维持MC3T3-E1前成骨细胞的形态和促进细胞增殖具有重要作用，并通过β-catenin/TCF1/Runx2信号轴参与调控MC3T3-E1细胞的成骨分化。颅骨转染MACF1质粒可以增加骨量和骨形成速率，并上调成骨分化标志基因。 虽然，这些结果提示MACF1与成骨分化关系密切，但这些研究仅对MACF1的功能进行了初步的研究，采用的实验材料也以细胞系为主，尚未在动物等其他水平对MACF1在体内参与骨形成的功能进行研究。作为重要的细胞结构分子，MACF1在骨骼发育和骨形成中起何作用？骨形成细胞中MACF1如何影响细胞骨架和成骨分化？MACF1通过什么机制参与调控成骨分化和骨形成？MACF1与骨质疏松疾病的发生是否存在潜在相关性？这些问题仍有待深入研究。 一、研究目的： （1）研究MACF1在小鼠骨骼发育不同阶段的生物学功能； （2）研究MACF1对MSCs成骨向分化过程中细胞骨架及功能的影响； （3）探究MACF1参与成骨分化调控的分子机理。 二、材料与方法： （1）收集了临床骨质疏松患者（60岁、80岁）和老龄小鼠（6、12、15、18、21、22月龄）骨组织来源的间充质干细胞，qPCR法检测了MACF1表达水平随着年龄或骨质疏松程度的变化规律；进一步采用Cre/LoxP方法构建了骨髓间充质干细胞中MACF1特异性敲除的小鼠模型； （2）在MACF1cKO小鼠胚胎期，采用透明骨架染色、显微CT、石蜡切片研究了MACF1缺失对骨骼发育的影响；而在成年至老年阶段，采用骨密度扫描、显微CT、三点弯曲、硬组织切片、血清ELISA、石蜡切片、钙黄绿素双标、骨组织形态计量学分析等方法，研究了缺失MACF1对骨量、骨骼力学性能、骨形成速率、骨重建等的影响； （3）分离MACF1cKO小鼠MSCs，采用细胞染色、免疫荧光、qPCR技术、Westernblot、细胞基底阻抗检测等方法，从细胞水平研究了MACF1条件性敲除对成骨细胞骨架、增殖、分化能力的影响。 （4）另外通过Co-IP、iTRAQ-MS/MS、构建带有NLS核定位信号的高表达载体等方法，研究了MACF1靶向下游转录因子SMAD7并调控骨形成的分子机理。 三、研究结果与结论： （1）MACF1正向调控骨形成，缺失MACF1将显著抑制骨骼发育和骨形成； 在胚胎期，缺失MACF1导致颅骨闭合延迟，长骨矿化能力减弱；在成年阶段，缺失MACF1导致小鼠骨量和骨形成速率降低，骨骼力学性能下降，骨表面成骨活动减弱而破骨功能增强。在老年阶段，缺失MACF1也降低了骨量，并促进了骨髓腔脂肪生成。 （2）MACF1协调MSCs的细胞骨架形态，缺失MACF1将导致微管细胞骨架和黏着斑形态异常； 在从MACF1cKO小鼠分离的MSCs中，缺失MACF1的细胞其微管骨架形态显著紊乱，而微丝骨架变化不大；另外，缺失MACF1导致MSCs的黏着斑形态异常，黏着斑变得更大和更细长。 （3）MACF1对MSCs的成骨向分化功能必不可少，MACF1直接靶向SMAD7并促进其入核从而调控成骨分化； 成骨向分化过程中，缺失MACF1导致MSCs的矿化能力和成骨分化相关基因表达显著降低。蛋白组学筛选发现，MACF1与SMAD7直接相互作用。胞浆与胞核中的SMAD7分别负向和正向调控成骨分化，而MACF1通过促进SMAD7入核可正向调控成骨分化和骨形成。 （4）MACF1缺失加速骨骼衰老表型，可能是老年性骨质疏松的重要诱发因子； 临床骨质疏松患者骨组织和老龄小鼠骨组织MSCs中，MACF1的表达水平与骨质疏松程度负相关，而缺失MACF1导致骨量减少且组织微结构退化，并且老年鼠中缺失MACF1可加剧这种退化，这些结果提示MACF1的缺失与骨质疏松的发生显著相关。 综上所述，本文首次从体内水平揭示了MACF1在骨形成和成骨分化调控中的功能，证实MACF1可直接靶向SMAD7并正向调控成骨分化，从而初步揭示了MACF1与骨质疏松疾病的潜在关系。这些研究结果不仅完善了对MACF1功能多样性的认识，更从转化医学的角度，为将MACF1作为骨质疏松等退行性骨骼疾病的标志物及治疗靶点提供了部分实验基础。
NETL