摘要
IFN-α是I型干扰素，具有广谱的抗病毒能力和免疫调节功能，在抗病毒治疗领域发挥了重要作用。牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)是引起牛呼吸道疾病和腹泻的重要病原之一，给养牛业造成了重大经济损失。本研究通过表达牛IFN-α,研究其在细胞水平和小鼠体内对BVDV的抑制效果,为BVDV的防治提供参考。 根据GenBank上收录的牛IFN-α基因序列，分析序列并去除信号肽，得到编码成熟蛋白序列，全基因合成后连接到原核表达载体pET-32a中，得到重组原核表达质粒pET-32a-BoIFN-α。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western-Blot分析表明，成功表达了重组牛IFN-α蛋白(BoIFN-α)。对目的蛋白的表达条件进行优化，确定目的蛋白最佳诱导条件:IPTG浓度1.0mmol/L,诱导6h。随后采用Ni柱亲和层析纯化，BCA测定纯化后的蛋白浓度为0.6mg/mL,采用尿素浓度梯度透析复性蛋白，得到目的蛋白。 将复性后的BoIFN-α蛋白经细胞病变抑制法测定活性为3.52×104IU/mL。将变性、纯化、复性后的BoIFN-α蛋白设置不同浓度梯度刺激MDBK细胞，与未处理组相比，重组BoIFN-α蛋白处理组的MDBK细胞ISG15、OAS1、IFIT1、Mx1和IFITM1等干扰素刺激基因(ISGs)的表达水平均显著上调，12h达高峰(P＜0.001),且呈剂量依赖性。以MOI为0.1和1.0的BVDV感染MDBK细胞。设置重组BoIFN-α蛋白预处理组和病毒感染后处理组，观察病毒增殖情况。与对照组相比，两种处理方式的BVDV的核酸拷贝数均显著下降(P＜0.01),且预处理组较病毒感染后处理组的病毒抑制效果更好。 本研究成功表达BoIFN-α蛋白，经变性、纯化和复性后的BoIFN-α蛋白具有良好的生物学活性,并能在体外抑制BVDV在MDBK细胞中的复制,为BoIFN-α作为BVDV的抗病毒药物和临床应用奠定了基础。初步解析了干扰素在抑制BVDV复制中ISG相关基因的变化规律，为牛干扰素产品的开发和牛病毒性腹泻防治提供参考。
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