摘要
背景与目的： 胶质母细胞瘤(GBM)是最具侵略性和致命性的恶性脑肿瘤，由于血脑屏障(BBB)的存在，许多药物难以透过BBB到达肿瘤部位，导致GBM的治疗难以达到理想的效果。值得注意的是，GBM在化疗过程中对细胞凋亡并不敏感，但对铁死亡较敏感。因此，开发能够通过穿过BBB有效靶向GBM并引发铁死亡的治疗方式对于改善治疗结果至关重要。本研究拟通过构建一种多功能仿生纳米平台L-D-I/NPs，旨在探讨L-D-I/NPs在GBM细胞生物学功能中的作用和穿越BBB靶向GBM而发生铁死亡的机制研究。同时，验证L-D-I/NPs在体内是否能有效抑制原位GBM的发生发展和延长小鼠GBM模型的生存期，为深入探讨GBM发生机制奠定基础，为更有效的治疗GBM提供新思路。 方法： 1、L-D-I/NPs的制备和表征 通过纳米沉淀法将DHA与ICG合成D-I/NPs，再利用LF进一步修饰和包裹合成L-D-I/NPs。然后通过透射电子显微镜（TEM）和马尔文粒度电位测定仪来检测L-D-I/NPs的形态、粒径和电势；紫外图谱扫描检测纳米颗粒的波长。此外，利用808激光器和1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)检测L-D-I/NPs的光热和光动水平。最后通过动态膜透析方法研究DHA和ICG从L-D-I/NPs中的释放行为。 2、L-D-I/NPs的体外细胞实验 采用荧光倒置显微镜对L-D-I/NPs的摄取行为进行定性和定量分析。同时通过DCFH-DA荧光探针来检测细胞内ROS的水平。此外，MTT实验分析了不同实验组对和GBM细胞的毒性。通过建立体外BBB模拟试验来评估L-D-I/NPs是否具有穿过BBB并杀死GBM细胞的能力。利用C11-BODIPY581/591和PhenGreenSK探针检测GBM细胞中脂质氧化水平和Fe2+的含量。Westernblot检测铁死亡相关蛋白（SLC7A11和GPX4）表达水平。 3、L-D-I/NPs的动物实验 通过小动物活体成像研究L-D-I/NPs在体内分布情况和利用红外热像仪记录了小鼠脑肿瘤经近红外光照射后温度变化。此外，通过观察L-D-I/NPs是否增强了肿瘤的体内治疗特性。最后采用苏木精-伊红(HE)染色和免疫组化评估肿瘤组织的形态变化。 结果： 1、L-D-I/NPs的制备和表征 通过对L-D-I/NPs的表征发现其具有规整的球形形状，粒径为120nm左右，电势接近-28.2，紫外吸收图谱在808nm附近有最大紫外吸收峰。而且在照射相同时间下,L-D-I/NPs的浓度越高，升温效果越好。此外，光动实验表明L-D-I/NPs可以产生大量的单线态氧。在pH=5.0的PBS中，L-D-I/NPs在48小时内释放的DHA约80%。 2、L-D-I/NPs促进GBM细胞ROS积累和脂质过氧化引起铁死亡 细胞摄取实验发现L-D-I/NPs在8h具有明显的红色荧光，达到了最大摄取能力，显示了L-D-I/NPs具有优越的细胞摄取行为。光动效果显示L-D-I/NPs组的荧光信号明显强于其他组，表明纳米颗粒能产生大量ROS。此外，MTT实验表明与其他组相比，L-D-I/NPs表现出最好的抗癌活性，也明显优于未使用激光照射的L-D-I/NPs。同时，我们发现L-D-I/NPs可以有效地穿过血脑屏障并杀死GBM细胞。利用C11-BODIPY581/591染色观察GBM细胞的荧光由红色变为绿色，说明L-D-I/NPs具有引起脂质过氧化的能力。此外，与其他组相比，L-D-I/NPs处理组的绿色荧光强度明显降低，表明L-D-I/NPs处理后细胞内Fe2+增加。Westernblot实验发现SLC7A11和GPX4条带信号减少，表明L-D-I/NPs处理可能有助于铁死亡的发生。 3、L-D-I/NPs在体内分布和抑制GBM增殖 L-D-I/NPs组在经尾静脉内给药后6小时显示出最强的荧光信号。此外，L-D-I/NPs在小鼠肿瘤部位荧光强度最高，经激光照射后L-D-I/NPs组中肿瘤区域的表面温度可能会高近10℃。与其他组相比，L-D-I/NPs处理的小鼠肿瘤生长延迟，生物发光最低。此外，L-D-I/NPs治疗组的体重下降幅度相对较小，证明了L-D-I/NPs的生物安全性和治疗效果。最后通过HE染色发现L-D-I/NPs治疗组有明显的肿瘤损伤。同时，免疫组化结果发现L-D-I/NPs治疗组的Ki67染色较其他组弱，而且在L-D-I/NPs治疗组中GPX4和SLC7A11的表达水平明显降低。最后各组器官进行组织学检查发现，与PBS组相比，L-D-I/NPs处理组的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏均未发现明显的组织学损伤。 结论 1、L-D-I/NPs能够与LRP1结合透过BBB并靶向GBM，引起GBM细胞ROS的累积与脂质过氧化从而诱导铁死亡发生。 2、体内实验明确了L-D-I/NPs的生物安全性和对GBM的抑制效果。
NETL