摘要
目的： 本研究以高脂喂饲SHR、3T3-L1脂肪细胞为研究对象，以脂联素水平及其多聚化过程为切入点，探究半夏白术天麻汤能否通过主动脉周围脂肪PPARγ介导脂联素与多聚化关键因子的表达，进而影响主动脉AMPK/AKT/eNOS信号通路，促进NO的释放而发挥调控血压的作用，揭示半夏白术天麻汤治疗高血压病合并血脂异常的分子生物学机制。 材料与方法： 实验一：采用随机数字表法将48只SHR随机分为高血压（SHR-ND）组、高脂喂饲高血压（SHR-HF）组、半夏白术天麻汤低、中、高剂量（BBTD-L、M、H）组、替米沙坦（TMST）组，每组8只，10只Wistar-Kyoto大鼠作为对照（WKY-ND）组。WKY-ND组、SHR-ND组大鼠给予基础饲料喂饲，其余5组给予高脂饲料喂饲，共喂饲8周。BBTD-L组、BBTD-M、BBTD-H组给予半夏白术天麻汤并按照2.52g/kg/d、5.04g/kg/d、10.08g/kg/d浓度进行灌胃，TMST组予替米沙坦8.4mg/kg/d浓度进行灌胃，WKY-ND组、SHR-ND组、SHR-HF组给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，共12周。于灌胃12周后采用智能无创血压仪分别测量各组大鼠尾动脉收缩压、舒张压，并计算平均动脉血压；对各组大鼠易激惹程度进行评分；测量体质量、腹围、身长，并计算Lee’s指数；采用两变量曲线回归分析体质量对收缩压、舒张压、平均动脉血压的影响，建立回归关系表达式；采用全自动生化分析仪检测血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量；HE染色法观察主动脉病理组织形态学变化。 实验二：动物造模、干预方法同论文一，由论文一中半夏白术天麻汤的干预效果筛选出BBTD-H组进行后续实验。应用HE染色法检测各组大鼠主动脉周围脂肪组织的病理形态学变化；ELISA法检测各组大鼠血清APN、TNF-α、IL-6水平；RT-qPCR法检测各组大鼠主动脉周围脂肪组织中脂联素多聚化相关因子（PPARγ、APN、DsbA-L）mRNA相对表达水平；WesternBlot法检测各组大鼠主动脉周围脂肪组织中脂联素多聚化相关因子（PPARγ、APN、DsbA-L）相对表达水平；RT-qPCR法检测各组大鼠主动脉AdipoR、APPLmRNA相对表达水平；WesternBlot法检测各组大鼠主动脉AdipoR、APPL及AMPK/AKT/eNOS通路相关因子的蛋白相对表达水平。 实验三：应用IBMX溶液、DEX溶液、胰岛素溶液诱导分化3T3-L1前脂肪细胞，油红O染色观察3T3-L1前脂肪细胞成熟程度。制备空白血清与半夏白术天麻汤含药血清，设置不同浓度（0、1.25%、2.5%、5%、10%、15%、20%、25%）的半夏白术天麻汤含药血清，采用CCK-8法筛选BBTD含药血清干预细胞的最佳给药浓度，设置不同时间（0、12h、24h、48h、72h），采用CCK-8法筛选BBTD含药血清干预细胞的最佳给药时间。采用RT-qPCR法检测不同浓度（0、10%、15%、20%）BBTD含药血清干预下APNmRNA表达，WesternBlot法检测不同浓度（0、10%、15%、20%）BBTD含药血清干预下APN蛋白表达。设置不同浓度（0、6.25、12.5、25、50、100、200、500μM）的T0070907，采用CCK-8法筛选T0070907干预细胞的最佳给药浓度。将成熟的脂肪细胞分为正常对照组（Control组）、空白血清组（Blank组）、半夏白术天麻汤含药血清组（BBTD组）和PPARγ抑制剂组（T0070907组）。正常对照组仅给予完全培养基培养，空白血清组给予含15%空白血清的完全培养基培养，半夏白术天麻汤含药血清组给予含15%半夏白术天麻汤含药血清的完全培养基培养，PPARγ抑制剂组在半夏白术天麻汤含药血清组基础上予浓度100μM的T0070907培养，干预24h。采用免疫荧光法检测脂肪细胞APN表达水平，采用WesternBlot法检测脂肪细胞PPARγ蛋白的相对表达水平，RT-qPCR法及WesternBlot法检测脂肪细胞APN、DsbA-L、ERp44、Ero1-LmRNA与蛋白的相对表达水平。 结果： 实验一： 1.血压变化：与WKY-ND组相比，SHR-ND组与SHR-HF组收缩压、舒张压及平均动脉血压水平均显著升高（P＜0.01）；与SHR-ND组相比，SHR-HF组收缩压、舒张压及平均动脉血压水平均有所升高（P＜0.05，P＜0.01）；与SHR-HF组相比，BBTD-L组、BBTD-M组、BBTD-H组收缩压、舒张压及平均动脉血压水平均显著下降（P＜0.01）。 2.易激惹评分变化：WKY-ND组易激惹评分主要为0分，共9只；SHR-ND组易激惹评分2、3分明显增多，分别为5只、2只；SHR-HF组易激惹评分主要为3分，共6只。半夏白术天麻汤干预后，易激惹评分均有不同程度的下降。 3.体质量、腹围、Lee’s指数变化：与WKY-ND组相比，SHR-ND组体质量、腹围、Lee’s指数有下降趋势，但差异未见统计学意义（P＞0.05）；与SHR-ND组相比，SHR-HF组体质量、腹围、Lee’s指数水平可见显著上升（P＜0.01）；与SHR-HF组比较，BBTD-M组、BBTD-H组体质量、腹围、Lee’s指数均有所下降（P＜0.01，P＜0.05），BBTD-L组体质量、腹围、Lee’s指数虽呈下降趋势，但差异未见统计学意义（P＞0.05）。 4.体质量与血压的回归分析：SHR体质量与收缩压、舒张压及平均动脉血压的变化呈直线正相关，其中体质量与收缩压之间Y=-92.57+0.72*X（R=0.664，R2=0.441，P＜0.01）；体质量与舒张压之间Y=-65.43+0.52*X（R=0.579，R2=0.336，P＜0.01）；体质量与平均动脉血压之间Y=-76.61+0.60*X（R=0.634，R2=0.402，P＜0.01）。 5.血清血脂水平变化：SHR-ND组比较，SHR-HF组血清中TG、TC、LDL-C的水平均有所上升（P＜0.05，P＜0.01），HDL-C水平显著下降（P＜0.01）；与SHR-HF组比较，BBTD-L组、BBTD-M组、BBTD-H组TG、TC、LDL-C的水平均可见显著下降（P＜0.01），HDL-C水平虽呈升高的趋势，但差异未见统计学意义（P＞0.05）。 6.主动脉病理组织学形态变化：与WKY-ND组相比，SHR-ND组与SHR-HF组主动脉内膜边缘粗糙，中膜层可见弹性纤维和平滑肌细胞排列紊乱且增生；与SHR-ND组相比，SHR-HF组可见部分内皮细胞增生，部分平滑肌细胞可见水样变性；与SHR-HF组相比，BBTD-L、M、H各组主动脉内膜边缘较为完整，内皮细胞增生情况有所减少，中膜弹性纤维和平滑肌细胞排列紊乱及增生的情况可见均有不同程度的恢复。 实验二： 1.主动脉周围脂肪组织病理形态变化：WKY-ND组与SHR-ND组主动脉周围脂肪组织染色均匀，脂肪细胞呈圆形或卵圆形，胞核扁圆形，脂肪细胞大小较为均匀一致。与SHR-ND组比较，SHR-HF组脂肪细胞单个细胞直径增大，脂肪空泡面积显著增大，胞核被挤至一边，排列较为混乱。 2.血清APN、TNF-α、IL-6、NO水平变化情况：与WKY-ND组比较，SHR-ND和SHR-HF组APN、NO水平均有所降低（P＜0.05，P＜0.01)，TNF-α、IL-6水平均有所提高（P＜0.05，P＜0.01）；与SHR-ND组比较，SHR-HF组APN、NO水平均显著降低（P＜0.01)，TNF-α、IL-6水平均有所提高（P＜0.05，P＜0.01）；BBTD组与SHR-HF组比较，APN、NO水平均显著提高（P＜0.01），TNF-α、IL-6水平均有所下降（P＜0.05，P＜0.01）。 3.主动脉周围脂肪组织脂联素多聚化相关因子变化：与WKY-ND组比较，SHR-ND组APN、PPARγ、DsbA-L的mRNA表达水平均有所下降（P＜0.05，P＜0.01），APN、PPARγ、DsbA-L蛋白表达均呈下降趋势，其中APN蛋白表达变化显著（P＜0.01）；SHR-HF组APN、PPARγ、DsbA-L的mRNA与蛋白表达均显著下降（P＜0.01)。与SHR-ND组比较，SHR-HF组APN、PPARγ、DsbA-L的mRNA表达均有所下降（P＜0.05，P＜0.01)，APN、PPARγ、DsbA-L蛋白表达均呈下降趋势，其中PPARγ、DsbA-L变化显著（P＜0.01)。与SHR-HF组比较，BBTD组APN、PPARγ、DsbA-L的mRNA表达均有所上升（P＜0.05，P＜0.01），APN、PPARγ、DsbA-L蛋白表达均呈上升趋势，其中APN、PPARγ变化显著（P＜0.05，P＜0.01）。 4.主动脉AdipoR、APPL表达变化：与WKY-ND组大鼠比较，SHR-ND组AdipoR、APPLmRNA表达均显著下降（P＜0.01），AdipoR、APPL蛋白表达呈下降趋势，其中APPL变化显著（P＜0.01）；SHR-HF组AdipoR、APPLmRNA和蛋白表达均显著下降（P＜0.01)；与SHR-ND组比较，SHR-HF组AdipoRmRNA和蛋白表达显著下降（P＜0.01)，APPLmRNA和蛋白表达呈下降趋势，但差异未见统计学意义（P＞0.05）；与SHR-HF组比较，BBTD组AdipoR、APPLmRNA表达均有所上升（P＜0.05），APPL蛋白表达显著上升（P＜0.01），AdipoR蛋白表达呈上升趋势，但差异未见统计学意义（P＞0.05）。 5.主动脉AMPK/AKT/eNOS通路变化：与WKY-ND组比较，SHR-ND组p-AMPK、p-AKT、p-eNOS蛋白表达均呈下降趋势，其中p-AKT、p-eNOS变化显著（P＜0.01），SHR-HF组p-AMPK、p-AKT、p-eNOS蛋白表达显著下降（P＜0.01)；与SHR-ND组比较，SHR-HF组p-AMPK、p-AKT、p-eNOS蛋白表达呈下降趋势，其中p-AKT下降明显（P＜0.05)；与SHR-HF组比较，BBTD组p-AMPK、p-AKT、p-eNOS蛋白表达呈上升趋势，其中p-AKT、p-eNOS变化显著（P＜0.05，P＜0.01）。 实验三： 1.油红O染色：诱导分化前的3T3-L1前脂肪细胞多呈梭形或菱形的成纤维细胞形态；诱导分化后，90%以上的细胞内有大量的红色脂滴，部分小脂滴融合为较大脂滴。 2.BBTD含药血清的最佳干预浓度：与对照组相比，BBTD含药血清浓度为10%、15%时脂肪细胞的活力显著上升（P＜0.01），BBTD含药血清浓度为25%时脂肪细胞活力显著降低（P＜0.01）。 3.BBTD含药血清的最佳干预时间：BBTD含药血清干预12h、24h后，脂肪细胞的活力呈上升趋势；与24h相比，细胞活力在BBTD含药血清干预48h、72h后呈下降趋势，但差异未见统计学意义（P＞0.05）。 4.不同浓度BBTD含药血清APN表达：与对照组比较，10%、15%、20%浓度的BBTD含药血清干预后APNmRNA和蛋白表达有所上升（P＜0.05，P＜0.01）；与15%浓度BBTD含药血清组相比，20%浓度的BBTD含药血清组的APNmRNA和蛋白表达有所下降（P＜0.05，P＜0.01）。 5.各组脂联素变化：与Control组相比，Blank组APNmRNA和蛋白表达未见明显差异（P＞0.05）；与Blank组相比，BBTD组mRNA和蛋白表达有所升高（P＜0.05，P＜0.01）；较BBTD组相比，T0070907组APNmRNA和蛋白表达显著下降（P＜0.01）。免疫荧光检测其趋势相同。 6.各组脂联素多聚化相关因子变化：与Control组相比，Blank组DsbA-L、ERp44、Ero1-LmRNA和蛋白表达未见明显差异（P＞0.05）；与Blank组相比，BBTD组DsbA-L、Ero1-LmRNA和蛋白表达均有所上升（P＜0.05，P＜0.01），ERp44mRNA表达显著下降（P＜0.01），ERp44蛋白表达呈下降趋势，但差异未见统计学意义（P＞0.05）；与BBTD组相比，T0070907组PPARγ蛋白表达均显著下降（P＜0.01），APN、DsbA-L、Ero1-LmRNA和蛋白表达均显著下降（P＜0.01），ERp44mRNA和蛋白表达有所上升（P＜0.05，P＜0.01）。 结论： 1.半夏白术天麻汤能够降低高脂喂饲SHR的血压和体质量，调节血脂紊乱，改善主动脉周围脂肪组织功能障碍。 2.半夏白术天麻汤能够通过主动脉周围脂肪组织PPARγ介导脂联素的水平与多聚化关键因子的表达，调控主动脉AMPK/AKT/eNOS信号通路，刺激NO释放，进而发挥调节血压的作用。
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